褐色脂肪組織における 生体内 代謝物交換を測定する動静脈メタボロミクス

要約

このプロトコルでは、マウスモデルのGC-MSを使用してBAT最適化された動静脈メタボロミクスに関連する方法が概説されています。これらの方法により、生物レベルでのBATを介した代謝物交換に関する貴重な洞察を得ることができます。

要約

褐色脂肪組織(BAT)は、非震え熱発生として知られる独自のエネルギー消費プロセスを通じて、代謝ホメオスタシスの調節に重要な役割を果たします。これを達成するために、BATは循環栄養素の多様なメニューを利用して、その高い代謝需要をサポートします。さらに、BATは代謝物由来の生理活性因子を分泌し、代謝燃料またはシグナル伝達分子として機能し、BATを介した組織内および/または組織間情報伝達を促進します。このことは、BATが全身の代謝物交換に積極的に関与していることを示唆しており、この興味深い特徴が研究され始めています。ここでは、 in vivo マウスレベルで最適化されたBAT動静脈メタボロミクスのプロトコールを紹介します。プロトコルは選択式に肩甲骨間BAT由来の静脈血および全身の幹線血を排出するSulzerの静脈を使用してthermogenic刺激および動静脈の採血技術のための関連した方法に焦点を合わせる。次に、これらの血液サンプルを用いたガスクロマトグラフィーベースのメタボロミクスプロトコルを実証します。この技術の使用は、BATによる代謝産物の正味の取り込みと放出を測定することにより、臓器間レベルでのBAT制御代謝物交換の理解を広げるはずです。

概要

褐色脂肪組織(BAT)は、ミトコンドリアの脱共役タンパク質1(UCP1)依存性およびUCP1非依存^{性メカニズムの両方}を含む、非震え熱発生(NST)として知られる独自のエネルギー消費特性を持っています1,2,3,4,5。これらの特徴的な特徴は、BATが全身代謝の調節と、肥満、2型糖尿病、心血管疾患、癌悪液質などの代謝性疾患の病因に関与しています^6,7,8。最近のレトロスペクティブ研究では、BAT量および/またはその代謝活動と肥満、高血糖、および心臓代謝の健康との逆相関が示されています^{ヒト9,10,11}。

近年、BATは熱発生燃料として大量の循環....

プロトコル

すべての実験は、成均館大学動物実験委員会(IACUC)の承認を得て行われました。マウスは、22°C、湿度45%に設定されたクリーンルームにあるIACUC承認の動物施設に収容され、毎日12時間の明暗サイクルが続きました。彼らは換気されたラックに保管され、標準的なチャウダイエット(60%の炭水化物、16%のタンパク質、3%の脂肪を含む)にアクセスできました。寝具や巣材は週替わりで変更しました。この研究では、生後12週齢、体重25g〜30gの雄のC57BL/6Jマウスを使用しました。これらの動物は、商業供給業者から調達されました( 材料表を参照)。

1. 温度順化と薬理刺激による褐色脂肪組織の代謝活性の調節

注:数日から数週間にわたる体温順化、またはβアドレナリン受容体作動薬を使用した薬理学的刺激は、BAT活性を調節するために一般的に採用されている方法です¹。したがって、読者が必要に応じて適切なアプローチを選択できるように、メソッドの簡潔な概要を以下に示します。代謝的に不活性な(熱産生性の低い)BATを得るために、C57BL/6Jマウスに対して、熱中性(28〜30°C)と呼ばれるベースラインの温熱が選択されます。この範囲により、マウスは体温を一定に保つために余分なエネルギーを費やす必要がなくなります。代謝的に適度また....

ディスカッション

全身のエネルギーバランスにおけるBATの代謝ポテンシャルを理解するための重要なステップは、BATが消費する栄養素、それらがどのように代謝処理されるか、およびどの代謝産物が循環に放出されるかを定義することです。このプロトコルは、Parkら⁴²によって最近開発および検証されたC57BL / 6Jマウスの肩甲骨間BATおよび全身性動脈血管系の静脈血管系へのアクセスを可能に.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C