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要約

このプロトコルでは、マウスモデルのGC-MSを使用してBAT最適化された動静脈メタボロミクスに関連する方法が概説されています。これらの方法により、生物レベルでのBATを介した代謝物交換に関する貴重な洞察を得ることができます。

要約

褐色脂肪組織(BAT)は、非震え熱発生として知られる独自のエネルギー消費プロセスを通じて、代謝ホメオスタシスの調節に重要な役割を果たします。これを達成するために、BATは循環栄養素の多様なメニューを利用して、その高い代謝需要をサポートします。さらに、BATは代謝物由来の生理活性因子を分泌し、代謝燃料またはシグナル伝達分子として機能し、BATを介した組織内および/または組織間情報伝達を促進します。このことは、BATが全身の代謝物交換に積極的に関与していることを示唆しており、この興味深い特徴が研究され始めています。ここでは、 in vivo マウスレベルで最適化されたBAT動静脈メタボロミクスのプロトコールを紹介します。プロトコルは選択式に肩甲骨間BAT由来の静脈血および全身の幹線血を排出するSulzerの静脈を使用してthermogenic刺激および動静脈の採血技術のための関連した方法に焦点を合わせる。次に、これらの血液サンプルを用いたガスクロマトグラフィーベースのメタボロミクスプロトコルを実証します。この技術の使用は、BATによる代謝産物の正味の取り込みと放出を測定することにより、臓器間レベルでのBAT制御代謝物交換の理解を広げるはずです。

概要

褐色脂肪組織(BAT)は、ミトコンドリアの脱共役タンパク質1(UCP1)依存性およびUCP1非依存性メカニズムの両方を含む、非震え熱発生(NST)として知られる独自のエネルギー消費特性を持っています1,2,3,4,5。これらの特徴的な特徴は、BATが全身代謝の調節と、肥満、2型糖尿病、心血管疾患、癌悪液質などの代謝性疾患の病因に関与しています6,7,8。最近のレトロスペクティブ研究では、BAT量および/またはその代謝活動と肥満、高血糖、および心臓代謝の健康との逆相関が示されていますヒト9,10,11。

近年、BATは熱発生燃料として大量の循環栄養素を必要とするため、NSTの維持を担う代謝吸収源として提案されている6,7。さらに、BATは、内分泌および/またはパラクリンシグナルとして作用する褐色アディポカインまたはBATokinesと呼ばれる生理活性因子を生成および放出することができ、システムレベルの代謝ホメオスタシスへの積極的な関与を示しています12,13,14,15。したがって、BATの栄養代謝を理解することは、体温調節器官としての従来の役割を超えて、ヒトにおけるその病態生理学的意義の理解を深めるはずです。

安定同位体トレーサーを用いたメタボロミクス研究は、非代謝性放射性トレーサーを用いた古典的な栄養素摂取研究と組み合わせることで、BATが優先的に取り込む栄養素とその利用方法に関する理解を大幅に向上させました16,17,18,19,20,21,22,23,24,25、26、27。例えば、放射性トレーサー研究は、低温活性化BATがグルコース、リポタンパク質結合脂肪酸、および分岐鎖アミノ酸を取り込むことを実証しています16,17,18,19,20,21,22,23,27.メタボロミクス研究と組み合わせた最近の同位体追跡により、組織および培養細胞内のこれらの栄養素の代謝運命とフラックスを測定することが可能になりました24,25,26,28,29,30。しかし、これらの解析は、主に栄養素の個々の利用に焦点を当てており、臓器代謝物交換におけるBATのシステムレベルの役割に関する知識は限られています。BATが消費する循環栄養素の特定のシリーズと、炭素と窒素に関するそれらの定量的寄与に関する疑問は、依然としてとらえどころのないままです。さらに、BATが栄養素を使用して代謝物由来のBATokine(リポカインなど)を生成および放出できるかどうかの調査は、12,13,14,15,31,32始まったばかりです。

動静脈血液分析は、臓器/組織における循環分子の特定の取り込みまたは放出を評価するために使用される古典的な生理学的アプローチです。この技術は、以前にラットの肩甲間BATに適用され、酸素といくつかの代謝産物を測定し、それによってBATをその異化能33,34,35,36,37を伴う適応熱発生の主要な部位として確立しました。最近、ラット肩甲骨間BATを用いた動静脈研究とトランスオミクスアプローチが組み合わされ、熱刺激されたBATによって放出される未発見のBATokinesの同定につながりました38。

近年の高感度ガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー質量分析(GC-MSおよびLC-MS)ベースのメタボロミクスの進歩により、臓器特異的な代謝産物交換の定量分析のための動静脈研究への関心が再燃しています39,40,41。これらの手法は、高い分離能と質量精度を備えているため、少量のサンプルで幅広い代謝物を包括的に分析できます。

これらの進歩に沿って、最近の研究では、動静脈メタボロミクスをマウスレベルでBATの研究に適合させることに成功し、さまざまな条件下でのBATの代謝産物交換活性の定量分析が可能になりました42。本稿では、C57BL/6JマウスモデルにおけるGC-MSを用いたBAT標的動静脈メタボロミクスプロトコルについて紹介します。

プロトコル

すべての実験は、成均館大学動物実験委員会(IACUC)の承認を得て行われました。マウスは、22°C、湿度45%に設定されたクリーンルームにあるIACUC承認の動物施設に収容され、毎日12時間の明暗サイクルが続きました。彼らは換気されたラックに保管され、標準的なチャウダイエット(60%の炭水化物、16%のタンパク質、3%の脂肪を含む)にアクセスできました。寝具や巣材は週替わりで変更しました。この研究では、生後12週齢、体重25g〜30gの雄のC57BL/6Jマウスを使用しました。これらの動物は、商業供給業者から調達されました( 材料表を参照)。

1. 温度順化と薬理刺激による褐色脂肪組織の代謝活性の調節

注:数日から数週間にわたる体温順化、またはβアドレナリン受容体作動薬を使用した薬理学的刺激は、BAT活性を調節するために一般的に採用されている方法です1。したがって、読者が必要に応じて適切なアプローチを選択できるように、メソッドの簡潔な概要を以下に示します。代謝的に不活性な(熱産生性の低い)BATを得るために、C57BL/6Jマウスに対して、熱中性(28〜30°C)と呼ばれるベースラインの温熱が選択されます。この範囲により、マウスは体温を一定に保つために余分なエネルギーを費やす必要がなくなります。代謝的に適度または高活性(熱産生)BATを得るには、それぞれ軽度の低温(20〜22°C)または重度の低温(6°C)を選択できます。この実験では、マウスを22°Cの標準的な飼育条件下で飼育したが、この条件はマウスにしてはやや低温であったが、薬理学的刺激は伴わなかった。

  1. 温度順応
    1. 温度順応を開始する少なくとも1週間前に、ケージごとに1〜2匹のマウスを飼育するようにマウスを分離します。換気、温度、湿度制御を備えたげっ歯類のインキュベーターを目的の条件で準備します。
    2. ケージをそれぞれのげっ歯類のインキュベーターに、選択したタイプの温度順応に適した日に移動させます。
    3. マウス数の分布がすべてのグループで均等であることを確認し、ケージごとに1匹または2匹のマウスを使用します。単一ハウジングは、グループハウジング43と比較して温度誘発性生理学的変化に対してより敏感であるため、好ましい。各グループの具体的な住宅条件は次のとおりです。
      1. 熱中性(30°C)群:この群のマウスを30°Cの温度で最大4週間連続して保持します。
      2. 重度の寒冷群:最初に、この群のマウスを巣材なしで18°Cで飼育します。週ごとの気温は徐々に下がり、第4週目には6°Cに達するでしょう。温度変化は、18°C→14°C→10°C→6°Cです。
      3. 軽度の寒冷群(20〜22°C):この群のマウスを、前述の標準的な飼育条件と同じ条件でげっ歯類のインキュベーターに収容します。
      4. 急性寒冷性チャレンジ:急性寒冷チャレンジの場合は、巣材なしでケージごとに1〜2匹のマウスを配置し、6°Cに設定されたげっ歯類のインキュベーターに最大8時間さらします。
        注:これらの飼育条件と温度変化は、BATの活性と代謝に対するさまざまな温度環境の影響を研究するために不可欠です。
    4. ケージを交換し、毎週餌と水を補充します。補充の少なくとも24時間前に、それぞれの温度(げっ歯類インキュベーター)でケージを事前に順応させます。
      注:適切な温度刺激の乱れを防ぐために、巣作りにつながる可能性のあるマウスの濃縮を提供しないことが重要です。ネズミは厳しい寒さに反応して体温を維持するためにより多くのエネルギーを消費し、その結果、食物摂取量が増加し、排泄率が高くなります。したがって、少なくとも週に2〜3回(地域の制度的ガイドラインに従って)ケージをチェックして、マウスに十分な餌と水が供給されていること、およびケージが過度に濡れていないことを確認することが重要です。このモニタリングは、研究中のマウスの健康と健康を維持するために不可欠です。
  2. β3-アドレナリン受容体作動薬CL316,243を用いた薬理刺激1
    1. 刺激効果を最大化するには、注射前にマウスを熱中性(30°C)で2〜4週間プレハウスします。
    2. 馴化期間後、1 mg / kg CL316,243を腹腔内に注射します。.
      注:β3-アドレナリン受容体アゴニストによる慢性刺激(例:3日から1,44,45週目まで)の場合、薬物の安定性のために毎日注射が必要です。希釈したCL316,243は、安定性のため、注射当日に調製する必要があります。

2. 動静脈採血

注:動静脈採血には、12〜14週間以上のマウスが最適です。若いマウスは、肩甲骨間BAT46から静脈血を特異的に排出する明確な血管であるスルザー静脈を十分に大きく持っていない可能性があります。

  1. 誘導用の3%イソフルラン(205 x 265 x 200 mmサイズのチャンバー内)とメンテナンス用の2%イソフルラン(ガス麻酔マスク付き)を備えた校正済み気化器を使用して穏やかに麻酔します。
    注:動静脈採血手順全体は、麻酔後速やかに実行する必要があります。.麻酔中に水温加温パッドを使用して、深部体温を維持することができます。
    注意:イソフルランは揮発性が高く、吸入すると有毒です。したがって、一次麻酔はドラフトの下で行う必要があります。
  2. 前足の引っ込みなどの動物の反射を確認して、麻酔が適切な深さに達していることを確認します。
  3. スルザーの静脈から静脈血を採取する
    1. マウスを背側の皮膚を露出させる位置に置き、切開する直前につま先をつまんで麻酔の深さを確認します。脱毛を防ぐために70%エタノールを多用した背側皮膚を湿らせ、胸部下部から首まで背中に沿って切開します。
      注:肩甲骨間BATは皮膚のすぐ下にあり、薄い白い脂肪組織で覆われた2つの脂肪パッドで構成されています。ガス麻酔マスクを通してマウスが麻酔下に留まるようにすることが重要です。
    2. 先端を曲げた鉗子で肩甲間BATをそっと持ち上げ、付着した組織(そのほとんどが筋肉)を慎重に切断します。脂肪パッドを頭に向かって持ち上げ、付着した組織を切断し続け、スルザー静脈(肩甲骨間BATの両方の脂肪パッドに接続された大きな「Y」字型の暗赤色の血管)が露出するまで、その領域を慎重に開きます。
      注:肩甲間BATの前部と側部に接続されている筋肉組織の毛細血管を切断すると、スルザー静脈から排出される血液の量と質が大幅に低下するため、注意が必要です。
    3. スルザーの静脈を慎重に切断し、ボトムカットの200 μLピペットチップとP100ピペットを使用して約40 μLの血液を採取します。採血チューブに血液を保管し、血清採取プロセスまでチューブを氷上に保管します。
      注:上大静脈47からの血液汚染を防ぐために、スルザー静脈のY字型分割点のすぐ下から血液を採取することが重要です。採血しすぎると、スルザーの静脈の特徴が低下します。したがって、分析のためにスルザーの静脈から必要最小限の血液を採取するようにしてください。血清と血漿は異なる代謝物プロファイルをもたらすため、採血管を選択する際には慎重に検討してください48,49,50。血漿採取には、ヘパリンでコーティングされたチューブを使用する必要があります。この実験では、血清を得るために凝固活性剤でコーティングされたチューブを選択しました。EDTAは質量分析信号51,52に大きな影響を与えるため、いかなる状況においてもEDTAコーティングされたチューブを使用しないでください。
  4. 左心室からの動脈血採取
    1. ノーズコーンへの接触を失わずにマウスをひっくり返して、腹側の皮膚を露出させます。つま先をつまんで麻酔の深さを確認してから切開します。腹側皮膚を70%エタノールで十分に湿らせて脱毛を防ぎ、胸腔をハサミで慎重に開き、内部構造を損なうことなく心臓を露出させます。
    2. 29 G(1/2インチ)の針を備えた1 mLシリンジを使用して、左心室の頂点領域を正確に穿刺します。.1/2インチの針の3分の2を心臓の頂点の右水平に3〜5 mmに挿入し(図1B)、シリンジを引き戻して左心室(50〜100μL)から血液を採取します。左心室からの血液は、真っ赤な酸素化された動脈血です。採血チューブに血液を保管し、血清採取プロセスまでチューブを氷上に保管します。
      注意: 心臓にアクセスするために、胸腔を最小限の切開で行う必要があります。過度の切開は局所出血につながり、その後低血圧を引き起こす可能性があります。これは、左心室から採取された動脈血の質に影響を与える可能性があります。心臓を回転させたりひっくり返したりすると、左心室の正確な位置を決定するのが難しくなるため、避けてください。
    3. 安楽死を行い、現地の機関のガイドラインに従って適切な方法で安楽死を確保してください。例えば、安楽死は子宮頸部脱臼によって行われ、心拍の停止によって確認することができる。
  5. 血液サンプルを10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を慎重に回収します。上清には、使用する採血管の種類に応じて、血清または血漿のいずれかが含まれている必要があります。ここで停止し、GC-MS分析用の血清処理までサンプルを-20°Cで保存することができます。
    注意: 赤い色の上清が観察された場合、溶血が発生した可能性があります。.溶血を避けるため、凝固が完了する前にサンプルをボルテックスします。グルタミンや乳酸などの一部の赤血球が豊富な代謝物は、データの誤解につながる可能性がありますが、ほとんどの代謝物は溶血の影響を大きく受けない可能性があります。.一週間以内に血清/血漿を分析することをお勧めします。.

3. 血清からの代謝物抽出および化学誘導体化

  1. 抽出の準備
    注:代謝物抽出、誘導体化、およびデータ分析を含むすべての方法は、以前に説明した方法53,54のわずかに修正されたバージョンです。
    1. 内部標準( 材料表を参照)の DL-ノルバリン溶液 100 μM を MS グレードのメタノールに添加して、抽出バッファーを調製します。
    2. すべての実験手順が氷上で行われていることを確認してください。
  2. スルザー静脈または左心室から抽出したマウス血清10 μLを、抽出バッファー40 μLを含む1.5 mL微量遠心チューブに移します。
  3. 細胞の破片とタンパク質を除去するには、血清サンプルを短時間ボルテックスした後、最高速度(18,000 x g)で4°Cで30分間遠心分離します。
  4. 遠心分離後、上清40μLをガラスバイアルに慎重に移し、4°Cの真空遠心分離機で3時間乾燥させます。
    注:プラスチックチューブの代わりにガラスインサート( 材料表を参照)は、その後の誘導体化ステップ全体で使用されるプラスチック反応性化学物質のため、推奨されます。
  5. 乾燥したサンプルを2つの連続した誘導体化ステップにかけ、血清代謝物のGC-MS分析を行います。
    注意: 次の手順は、溶剤の刺激リスクがあるため、ドラフト内で実行する必要があります。
    1. 乾燥血清抽出物をピリジンに溶解した10 mg/mL塩酸メトキシアミン( 材料表参照)30 μLに再懸濁し、37°Cで30分間インキュベートします。
    2. 70 μL の N-メチル-N-tert-ブチルジメチルシリルリフルオロアセトアミド(MTBSTFA、 材料表を参照)で 70 °C で 1 時間、代謝物のシリル化のためにサンプルを誘導体化します。
      注:プラスチックと反応する誘導体化溶媒のため、次の手順ではプラスチックチップではなくガラスシリンジを使用することをお勧めします。

4. GC-MSを用いたメタボロミクス解析

注:スルザー静脈および左心室からの誘導体化サンプル中の炭水化物、アミノ酸、TCA サイクル中間体を含むさまざまな血清代謝物を測定するために、シングル四重GC-MS( 材料表を参照)を使用しました。他のカラムを使用することもできますが、温度プログラムを含む実験設定は、使用するカラムの種類によって異なる場合があります。

  1. ヘリウムをキャリアガスとして使用し、流速 1.500 mL/分(設定値)で 1 μL の誘導体化サンプルをスプリットレスモードで GC に注入します。
  2. 四重極を 200 °C に設定し、GC-MS インターフェースを 300 °C に設定します。
    注:すべての代謝物分析のオーブンプログラムは、60°Cから始まり、1分間保持された後、温度が320°Cに達するまで10°C/分の速度で増加します。
  3. 70 eVに設定した電子イオン化(EI)によってデータを収集し、スキャンモード(50-550 m / z)53でサンプルデータを取得します。この試験で使用したすべての代謝物は、マススペクトルと保持時間を確認するための標準試料で事前に検証されています。
  4. 市販の解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用してピーク面積積分を実施します。
  5. 化合物を各TBMDS誘導体のプロダクトイオンと一致させます。次に、フラグメントイオンの m/z 値を対応するピーク面積で積分して抽出イオンクロマトグラム(EIC)を取得し、エクスポートします。フラグメントイオンを 表1に示す。
    注:各化合物の EIC は、各サンプルの DL-ノルバリンの EIC で正規化されました。データは、各正規化されたEIC値を使用して、左心室へのLog2 Sulzer静脈(Log2(SV / LV))で表されます。

結果

図1 は、BATに最適化されたAVメタボロミクスの実験スキームを示しています。プロトコルのセクションで述べられるように、差動的に刺激された褐色の脂肪ティッシュを得るためには、マウスは齧歯類の定温器を使用して温度の順化を経るか、またはβアドレナリン作動性受容器のアゴニストのような薬理学的な管理を受ける。その後、マウスに麻酔をかけ、メタボロミ?...

ディスカッション

全身のエネルギーバランスにおけるBATの代謝ポテンシャルを理解するための重要なステップは、BATが消費する栄養素、それらがどのように代謝処理されるか、およびどの代謝産物が循環に放出されるかを定義することです。このプロトコルは、Parkら42によって最近開発および検証されたC57BL / 6Jマウスの肩甲骨間BATおよび全身性動脈血管系の静脈血管系へのアクセスを可能に...

開示事項

著者らは、報告すべき利益相反がないことを宣言します。

謝辞

方法論的な議論をしてくれたChoiとJungの研究室のメンバー全員に感謝します。C. Jang 氏と D. Guertin 氏のアドバイスとフィードバックに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたM.S. Choiに感謝します。この研究は、NRF-2022R1C1C1012034 から S.M.J. に資金提供されました。NRF-2022R1C1C1007023からDWC;NRF-2022R1A4A3024551 から S.M.J. および D.W.C.この研究は、忠南大学校WTKの支援を受けて行われました。 図1と図2はBioRender(http://biorender.com/)を使用して作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5-20 µL Filter TipsAxygenAX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"BD Biosciences309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)AgilentG7077B
Agilent 7693A AutosamplerAgilentG4513A
Agilent 8890 GC SystemAgilentG3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UIAgilent19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)AgilentG3335-90240
C57BL/6J mouseDBLC57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)LABCONCO 7811041
DL-NorvalineSigma-AldrichN7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430REppendorf5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30120086
Glass insert 250 μL Agilent5181-1270
Methanol (LC-MS grade)Sigma-AldrichQ34966-1L
Methoxyamine hydrochlorideSigma-Aldrich226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat baseSarstedt20.1290.100
MTBSTFASigma-Aldrich394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)Sigma-Aldrich270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum ConcentratorsLABCONCO 7310041
Rodent dietSAFESAFE R+40-10
Rodent incubatorPower scientificRIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"BD Biosciences328203
Vial Cap 9 mmAgilent5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mLAgilent5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40AxygenPCR-02-C

参考文献

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