מטבולומיקה עורקית למדידה בחילוף מטבוליטים של Vivo ברקמת שומן חומה

Summary

בפרוטוקול זה מתוארות שיטות רלוונטיות למטבוליקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר. שיטות אלה מאפשרות רכישת תובנות יקרות ערך לגבי חילופי מטבוליטים בתיווך BAT ברמת האורגניזם.

Abstract

רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד מכריע בוויסות הומאוסטזיס מטבולי באמצעות תהליך ייחודי של הוצאת אנרגיה המכונה תרמוגנזה שאינה רועדת. כדי להשיג זאת, BAT משתמשת בתפריט מגוון של חומרים מזינים במחזור כדי לתמוך בביקוש המטבולי הגבוה שלה. בנוסף, BAT מפריש גורמים ביו-אקטיביים שמקורם במטבוליטים שיכולים לשמש כדלקים מטבוליים או מולקולות איתות, מה שמקל על תקשורת תוך-רקמתית ו/או בין-רקמתית בתיווך BAT. זה מצביע על כך ש- BAT משתתף באופן פעיל בחילופי מטבוליטים מערכתיים, תכונה מעניינת שמתחילה להיחקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור metabolomics arteriovenous BAT ממוטב ברמת עכבר in vivo . הפרוטוקול מתמקד בשיטות רלוונטיות לגירויים תרמוגניים ובטכניקת דגימת דם עורקית באמצעות וריד זולצר, המנקז באופן סלקטיבי דם ורידי בין-סקפולרי שמקורו ב-BAT ודם עורקי סיסטמי. לאחר מכן, מודגם פרוטוקול מטאבולומיקה מבוסס כרומטוגרפיית גז באמצעות דגימות דם אלה. השימוש בטכניקה זו אמור להרחיב את ההבנה של חילופי מטבוליטים מווסתים על ידי BAT ברמה הבין-איברית על ידי מדידת ספיגה נטו ושחרור של מטבוליטים על ידי BAT.

Introduction

רקמת שומן חומה (BAT) היא בעלת תכונת הוצאת אנרגיה ייחודית הידועה בשם תרמוגנזה לא רועדת (NST), הכוללת הן את המנגנונים התלויים בחלבון 1 (UCP1) והן במנגנונים שאינם תלויים ב-UCP1 (UCP1) ו-UCP1 שאינם^תלויים ב-UCP1 1,2,3,4,5. מאפיינים ייחודיים אלה משלבים BAT בוויסות חילוף החומרים המערכתי ובפתוגנזה של מחלות מטבוליות, כולל השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם וסרטן קכסיה ^6,7,8. מחקרים רטרוספקטיביים....

Protocol

כל הניסויים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סונגקיונקוואן (IACUC). עכברים שוכנו במתקן בעלי חיים שאושר על ידי IACUC הממוקם בחדר נקי שנקבע על 22 מעלות צלזיוס ו-45% לחות, לאחר מחזור יומי של 12 שעות אור/חושך. הם הוחזקו במדפים מאווררים והייתה להם גישה לדיאטת צ'או סטנדרטית (המורכבת מ-60% פחמימות, 16% חלבון ו-3% שומן). מצעים וחומרי קינון הוחלפו על בסיס שבועי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 12 שבועות ובמשקל שבין 25 גרם ל-30 גרם. בעלי חיים אלה הגיעו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. אפנון הפעילות המטבולית של רקמת השומן החום באמצעות אקלום טמפרטורה וגירוי תרופתי

תוצאות

איור 1 מדגים את סכמת הניסוי של מטבולומיקה AV ממוטבת BAT. כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, כדי להשיג רקמות שומן חום מגורה באופן דיפרנציאלי, עכברים עוברים אקלום טמפרטורה באמצעות אינקובטורים מכרסמים או מקבלים טיפול תרופתי כגון אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי. לאחר מכן, עכברים מורדמים, וד?.......

Discussion

צעד קריטי בהבנת הפוטנציאל המטבולי של BAT במאזן האנרגיה של כל הגוף הוא להגדיר אילו חומרים מזינים הוא צורך, כיצד הם מעובדים מטבולית, ואילו מטבוליטים משתחררים למחזור הדם. פרוטוקול זה מציג טכניקת דגימה עורקית מיוחדת המאפשרת גישה לכלי הדם הוורידיים של BAT בין-סקפולרי וכלי דם עורקיים מערכתיים בעכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C