JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בפרוטוקול זה מתוארות שיטות רלוונטיות למטבוליקה עורקית מותאמת ל-BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר. שיטות אלה מאפשרות רכישת תובנות יקרות ערך לגבי חילופי מטבוליטים בתיווך BAT ברמת האורגניזם.

Abstract

רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד מכריע בוויסות הומאוסטזיס מטבולי באמצעות תהליך ייחודי של הוצאת אנרגיה המכונה תרמוגנזה שאינה רועדת. כדי להשיג זאת, BAT משתמשת בתפריט מגוון של חומרים מזינים במחזור כדי לתמוך בביקוש המטבולי הגבוה שלה. בנוסף, BAT מפריש גורמים ביו-אקטיביים שמקורם במטבוליטים שיכולים לשמש כדלקים מטבוליים או מולקולות איתות, מה שמקל על תקשורת תוך-רקמתית ו/או בין-רקמתית בתיווך BAT. זה מצביע על כך ש- BAT משתתף באופן פעיל בחילופי מטבוליטים מערכתיים, תכונה מעניינת שמתחילה להיחקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור metabolomics arteriovenous BAT ממוטב ברמת עכבר in vivo . הפרוטוקול מתמקד בשיטות רלוונטיות לגירויים תרמוגניים ובטכניקת דגימת דם עורקית באמצעות וריד זולצר, המנקז באופן סלקטיבי דם ורידי בין-סקפולרי שמקורו ב-BAT ודם עורקי סיסטמי. לאחר מכן, מודגם פרוטוקול מטאבולומיקה מבוסס כרומטוגרפיית גז באמצעות דגימות דם אלה. השימוש בטכניקה זו אמור להרחיב את ההבנה של חילופי מטבוליטים מווסתים על ידי BAT ברמה הבין-איברית על ידי מדידת ספיגה נטו ושחרור של מטבוליטים על ידי BAT.

Introduction

רקמת שומן חומה (BAT) היא בעלת תכונת הוצאת אנרגיה ייחודית הידועה בשם תרמוגנזה לא רועדת (NST), הכוללת הן את המנגנונים התלויים בחלבון 1 (UCP1) והן במנגנונים שאינם תלויים ב-UCP1 (UCP1) ו-UCP1 שאינםתלויים ב-UCP1 1,2,3,4,5. מאפיינים ייחודיים אלה משלבים BAT בוויסות חילוף החומרים המערכתי ובפתוגנזה של מחלות מטבוליות, כולל השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם וסרטן קכסיה 6,7,8. מחקרים רטרוספקטיביים אחרונים הראו קשר הפוך בין מסת BAT ו / או הפעילות המטבולית שלה עם השמנת יתר, היפרגליקמיה, ובריאות cardiometabolic בבני אדם 9,10,11.

לאחרונה, BAT הוצע ככיור מטבולי האחראי על שמירה על NST, מכיוון שהוא דורש כמויות משמעותיות של חומרים מזינים במחזור כמו דלק תרמוגני 6,7. יתר על כן, BAT יכול ליצור ולשחרר גורמים ביו-אקטיביים, המכונים אדיפוקינים חומים או BATokines, הפועלים כאותות אנדוקריניים ו / או פרקריניים, המצביעים על מעורבותו הפעילה בהומאוסטזיס מטבולי ברמת המערכת 12,13,14,15. לכן, הבנת חילוף החומרים התזונתי של באט אמורה לשפר את הבנתנו את משמעותו הפתופיזיולוגית בבני אדם, מעבר לתפקידו הקונבנציונלי כאיבר תרמו-רגולטורי.

מחקרים מטאבולומיים המשתמשים בעוקבי איזוטופים יציבים, בשילוב עם מחקרי ספיגת חומרים מזינים קלאסיים המשתמשים ברדיוטרייסרים שאינם ניתנים לחילוף חומרים, שיפרו באופן משמעותי את הבנתנו אילו חומרים מזינים נלקחים באופן מועדף על ידי BAT וכיצד הם מנוצלים 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27. לדוגמה, מחקרי נותב רדיואקטיבי הראו כי BAT המופעל בקור לוקח גלוקוז, חומצות שומן הקשורות לליפופרוטאין, וחומצות אמינו מסועפות שרשרת 16,17,18,19,20,21,22,23,27. מעקב איזוטופים עדכני בשילוב עם מחקרים מטבוליים אפשרו לנו למדוד את הגורל המטבולי והשטף של חומרים מזינים אלה בתוך רקמות ותאים בתרבית 24,25,26,28,29,30. עם זאת, ניתוחים אלה מתמקדים בעיקר בניצול אינדיבידואלי של חומרים מזינים, ומשאירים אותנו עם ידע מוגבל על התפקידים ברמת המערכות של BAT בחילוף מטבוליטים של איברים. שאלות לגבי הסדרה הספציפית של חומרים מזינים במחזור הדם הנצרכים על ידי BAT ותרומותיהם הכמותיות במונחים של פחמן וחנקן נותרו חמקמקות. בנוסף, המחקר האם BAT יכול לייצר ולשחרר BATokines שמקורם במטבוליטים (למשל, ליפוקינים) באמצעות חומרים מזינים רק מתחיל 12,13,14,15,31,32.

ניתוח דם עורקי הוא גישה פיזיולוגית קלאסית המשמשת להערכת ספיגה או שחרור ספציפיים של מולקולות במחזור הדם באיברים/רקמות. טכניקה זו יושמה בעבר על BAT interscapular של חולדות כדי למדוד חמצן וכמה מטבוליטים, ובכך ביסס BAT כאתר העיקרי של תרמוגנזה אדפטיבית עם הפוטנציאל הקטבולי שלה 33,34,35,36,37. לאחרונה, מחקר עורקי באמצעות BAT interscapular של חולדות שולב בשילוב עם גישה טרנס-אומיקס, מה שהוביל לזיהוי של BATokines שלא התגלו ששוחררו על ידי BAT38 מגורה תרמוגנית.

ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה מבוססת כרומטוגרפיית גז וכרומטוגרפיה נוזלית ברגישות גבוהה (GC-MS ו- LC-MS) הציתה מחדש את העניין במחקרים עורקיים לניתוח כמותי של חילופי מטבוליטים ספציפיים לאיברים 39,40,41. טכניקות אלה, עם כוח הרזולוציה הגבוה שלהן ודיוק המסה שלהן, מאפשרות ניתוח מקיף של מגוון רחב של מטבוליטים באמצעות כמויות מדגם קטנות.

בהתאם להתקדמות זו, מחקר שנערך לאחרונה התאים בהצלחה מטבולומיקה עורקית לחקר BAT ברמת העכבר, ואיפשר ניתוח כמותי של פעילויות חילופי מטבוליטים ב- BAT בתנאים שונים42. מאמר זה מציג פרוטוקול מטבולומיקה עורקית ממוקד BAT באמצעות GC-MS במודל עכבר C57BL/6J.

Protocol

כל הניסויים נערכו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סונגקיונקוואן (IACUC). עכברים שוכנו במתקן בעלי חיים שאושר על ידי IACUC הממוקם בחדר נקי שנקבע על 22 מעלות צלזיוס ו-45% לחות, לאחר מחזור יומי של 12 שעות אור/חושך. הם הוחזקו במדפים מאווררים והייתה להם גישה לדיאטת צ'או סטנדרטית (המורכבת מ-60% פחמימות, 16% חלבון ו-3% שומן). מצעים וחומרי קינון הוחלפו על בסיס שבועי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 12 שבועות ובמשקל שבין 25 גרם ל-30 גרם. בעלי חיים אלה הגיעו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. אפנון הפעילות המטבולית של רקמת השומן החום באמצעות אקלום טמפרטורה וגירוי תרופתי

הערה: אקלום טמפרטורה במשך מספר ימים עד שבועות או גירוי תרופתי באמצעות אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי הן שיטות נפוצות לוויסות פעילות BAT1. לכן, סקירה תמציתית של השיטה מובאת להלן כדי לאפשר לקוראים לבחור את הגישה המתאימה כנדרש. כדי לקבל BAT לא פעיל מטבולית (פחות תרמוגני), נבחרה טמפרטורת חום בסיסית, המכונה ניטרליות תרמית (28-30 מעלות צלזיוס), עבור עכברי C57BL/6J. טווח זה מבטיח שהעכברים לא יצטרכו להוציא אנרגיה נוספת כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה. כדי להשיג BAT מטבולית צנועה או פעילה מאוד (תרמוגנית), ניתן לבחור בטמפרטורות קור קל (20-22 מעלות צלזיוס) או קור חמור (6 מעלות צלזיוס), בהתאמה. לצורך ניסוי זה, עכברים גודלו בתנאי דיור סטנדרטיים של 22 מעלות צלזיוס, אשר, למרות קור קל עבור עכברים, לא היו כרוכים בגירויים פרמקולוגיים כלשהם.

  1. התאקלמות טמפרטורה
    1. הפרידו את העכברים כדי לאכלס עכבר אחד או שניים בכל כלוב לפחות שבוע לפני תחילת אקלום הטמפרטורה. הכינו אינקובטורים למכרסמים המצוידים בבקרת אוורור, טמפרטורה ולחות בתנאים הרצויים.
    2. העבירו את הכלובים לאינקובטורים המתאימים למכרסמים בימים המתאימים לסוג ההסתגלות הנבחר לטמפרטורה.
    3. ודא שהתפלגות מספרי העכברים אחידה בכל הקבוצות, עם עכבר אחד או שניים בכל כלוב. דיור יחיד מועדף מכיוון שהוא רגיש יותר לשינויים פיזיולוגיים הנגרמים על ידי טמפרטורה בהשוואה לדיור קבוצתי43. להלן תנאי הדיור הספציפיים לכל קבוצה:
      1. קבוצת ניטרליות תרמית (30°C): שמרו על העכברים בקבוצה זו ברציפות בטמפרטורה של 30°C למשך עד ארבעה שבועות.
      2. קבוצת קור קשה: בתחילה, לשכן את העכברים בקבוצה זו ב 18 מעלות צלזיוס ללא כל חומרי קינון. הם יחוו ירידה הדרגתית בטמפרטורה השבועית, ויגיעו ל -6 °C (66 °F) בשבוע הרביעי. התקדמות הטמפרטורה היא כדלקמן: 18 °C → 14 °C (75 °F) → 10 °C (75 °F) → 6 °C (66 °F).
      3. קבוצת קור קלה (20-22 מעלות צלזיוס): מאכלסים את העכברים בקבוצה זו באינקובטורים של מכרסמים באותם תנאים כמו תנאי דיור סטנדרטיים שהוזכרו קודם לכן.
      4. אתגרי קור אקוטיים: לאתגרי קור אקוטיים, הניחו 1-2 עכברים בכל כלוב ללא חומרי קינון וחשפו אותם לאינקובטור מכרסמים בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס למשך עד 8 שעות.
        הערה: תנאי דיור אלה ושינויי טמפרטורה חיוניים לחקר ההשפעות של סביבות טמפרטורה שונות על פעילות BAT וחילוף חומרים.
    4. החליפו כלובים וחדשו מזון ומים מדי שבוע. יש להקדים את הכלובים לפחות 24 שעות לפני נטילת התוסף, בטמפרטורה המתאימה להם (אינקובטור מכרסמים).
      הערה: כדי למנוע הפרעה של גירוי הטמפרטורה המתאים, חשוב לא לספק העשרה עכברית שעלולה להוביל לבניית קן. בתגובה לקור עז, עכברים מוציאים יותר אנרגיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, וכתוצאה מכך צריכת מזון מוגברת ושיעורי הפרשה גבוהים יותר. לכן, חשוב לבדוק את הכלובים לפחות פעמיים-שלוש בשבוע (בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות) כדי לוודא שלעכברים יש אספקה נאותה של מזון ומים ושהכלובים אינם רטובים יתר על המידה. ניטור זה חיוני לשמירה על רווחתם ובריאותם של העכברים במהלך המחקר.
  2. גירוי פרמקולוגי1 באמצעות אגוניסט לקולטן β3-אדרנרגי CL316,243
    1. כדי למקסם את אפקט הגירוי, מקמו את העכברים בטמפרטורה של ניטרליות תרמית (30°C) למשך 2-4 שבועות לפני הזרקות.
    2. לאחר תקופת ההתאקלמות, יש להזריק תוך צפקית 1 מ"ג/ק"ג CL316,243.
      הערה: עבור גירוי כרוני עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic (למשל מ 3 ימים עד שבועות 1,44,45), זריקות יומיות נדרשות עקב יציבות התרופה. CL316,243 מדולל צריך להיות מוכן ביום ההזרקה עקב יציבות.

2. דגימת דם עורקית

הערה: עכברים מעל 12-14 שבועות מומלצים ביותר לדגימת דם עורקית. ייתכן שלעכברים צעירים יותר אין וורידים בגודל מספיק של זולצר, כלי דם נפרד המנקז באופן ספציפי דם ורידי מה-BAT46 הבין-סקפולרי.

  1. מרדימים בעדינות באמצעות וופורייזר מכויל עם 3% איזופלורן לאינדוקציה (בתא בגודל 205 x 265 x 200 מ"מ) ו-2% איזופלורן לתחזוקה (עם מסכת הרדמה גז).
    הערה: יש לבצע את כל הליך דגימת הדם העורקי מיד לאחר ההרדמה. ניתן להשתמש בכרית חימום מחוממת במים במהלך ההרדמה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה.
    אזהרה: איזופלורן נדיף מאוד ורעיל בשאיפה. לכן, הרדמה ראשונית חייבת להתבצע תחת מכסה אדים.
  2. אמת את הרפלקסים של בעל החיים כגון נסיגת כפות כדי לוודא שההרדמה הגיעה לעומק מתאים.
  3. איסוף דם ורידי מווריד הזלצר
    1. מקם את העכבר כדי לחשוף את העור הגבי, לאשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן ממש לפני ביצוע החתך. יש להרטיב את העור הגבי עם אתנול בשפע של 70% כדי למנוע ניתוק שיער, ולבצע חתך לאורך הגב מהחלק התחתון של בית החזה עד הצוואר.
      הערה: העטלף הבין-סקפולרי ממוקם ממש מתחת לעור, ומורכב משתי רפידות שומן המכוסות ברקמות שומן לבנות דקות. חשוב לוודא כי העכבר נשאר תחת הרדמה באמצעות מסכת הרדמה גז.
    2. הרימו בעדינות את ה-BAT הבין-סקפולרי בעזרת מלקחיים מכופפים וחתכו בזהירות את הרקמות המצורפות, שרובן שרירים. הרימו את כרית השומן לכיוון הראש, המשיכו לחתוך את הרקמות המחוברות ופתחו בזהירות את האזור עד לחשיפת וריד הזולצר (כלי דם אדום כהה גדול בצורת 'Y' המחובר לשתי כריות השומן של עטלף בין-סקפולרי).
      הערה: היזהר לא לחתוך את כלי הדם הנימים של רקמות שריר הקשורים לאזור הקדמי והצידי של BAT interscapular, שכן פעולה זו תפחית באופן משמעותי את כמות ואיכות הדם המתנקז מווריד זולצר.
    3. בזהירות לחתוך את הווריד של Sulzer, ולאסוף כ 40 μL של דם באמצעות חתך תחתון 200 μL פיפטה קצוות פיפטה פיפטה P100. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום.
      הערה: חשוב לאסוף דם ממש מתחת לנקודת החלוקה בצורת Y של וריד זולצר, כדי למנוע זיהום דם מהווריד הוורידי העליון קאווה47. איסוף יותר מדי דם יפחית את המאפיינים של הווריד של זולצר. לכן, הקפד לאסוף את כמות הדם המינימלית הדרושה מן הווריד של Sulzer לניתוח. היו מתחשבים בבחירת צינורות איסוף הדם, שכן סרום ופלזמה מניבים פרופילי מטבוליטים שונים 48,49,50. עבור אוסף פלזמה, יש צורך להשתמש צינורות מצופים הפרין. בניסוי זה נבחרו צינורות מצופים אקטיבטור קרישה לקבלת סרום. בשום פנים ואופן אין להשתמש בצינורות מצופים EDTA, מכיוון ש- EDTA משפיע באופן משמעותי על אותות ספקטרומטריית מסה51,52.
  4. איסוף דם עורקי מהחדר השמאלי
    1. הפוך את העכבר מבלי לאבד מגע עם חרוט האף, כדי לחשוף את העור הגחוני. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן לפני ביצוע החתך. להרטיב את העור הגחוני עם כמות מספקת של 70% אתנול כדי למנוע ניתוק שיער, בזהירות לפתוח את חלל החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב מבלי לפגוע בכל מבנה פנימי.
    2. נקב במדויק את אזור הקודקוד של החדר השמאלי באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 29 גרם (1/2 אינץ'). הכניסו שני שלישים של מחט בגודל 1/2 אינץ' ל-3-5 מ"מ לרוחב הימני של קודקוד הלב (איור 1B), ומשכו את המזרק לאחור כדי לאסוף דם מהחדר השמאלי (50-100 מיקרוליטר). דם מהחדר השמאלי הוא דם עורקי מחומצן שהוא אדום בוהק. אחסנו את הדם בצינור איסוף דם, ושמרו את הצינורית על קרח עד לתהליך איסוף הסרום.
      הערה: יש לבצע חתך מינימלי בחלל החזה לצורך גישה ללב. חתך יתר עלול להוביל לדימום מקומי, אשר עלול לגרום לאחר מכן ללחץ דם נמוך. זה יכול להשפיע על איכות הדם העורקי שנאסף מהחדר השמאלי. הימנע סיבוב או היפוך הלב, כפי שהוא יקשה על קביעת המיקום המדויק של החדר השמאלי.
    3. לבצע המתת חסד ולהבטיח אותה בשיטה מתאימה בהתאם להנחיות המוסדות המקומיים. לדוגמה, המתת חסד יכולה להתבצע באמצעות פריקת צוואר הרחם ואושר על ידי הפסקת פעימות הלב.
  5. דגימות דם צנטריפוגטיות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. הסופרנאטנט צריך להכיל סרום או פלזמה בהתאם לסוג צינור איסוף הדם בו משתמשים. אפשר לעצור כאן ולאחסן את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד עיבוד הסרום לניתוח GC-MS.
    הערה: ייתכן שהמוליזה התרחשה אם נצפית סופרנאטנט בצבע אדום. כדי למנוע המוליזה, מערבלים את הדגימה לפני השלמת הקרישה. חלק מהמטבוליטים המועשרים בכדוריות דם אדומות, כולל גלוטמין ולקטט, עלולים להוביל לפרשנות שגויה של נתונים, אם כי רוב המטבוליטים עשויים שלא להיות מושפעים באופן משמעותי מהמוליזה. מומלץ לנתח את הסרום/פלזמה תוך שבוע.

3. מיצוי מטבוליטים מסרום ופירוק כימי

  1. הכנה למיצוי
    הערה: כל השיטות, כולל מיצוי מטבוליטים, דה-ריווטציה וניתוח נתונים, הן גרסאות מעט שונות של שיטותשתוארו קודם לכן 53,54.
    1. הכן את מאגר המיצוי על ידי הוספת תמיסת 100 מיקרומטר של DL-norvaline, תקן פנימי (ראה טבלת חומרים), למתנול ברמת MS.
    2. ודא שכל הליכי הניסוי מתבצעים על קרח.
  2. מעבירים 10 μL של נסיוב עכברים המופק מווריד הזולצר או מהחדר השמאלי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 40 μL של חיץ מיצוי.
  3. כדי להסיר פסולת תאים וחלבון, מערבל לזמן קצר את דגימות הסרום, ולאחר מכן את הצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  4. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים בזהירות 40 μL של supernatant לתוך בקבוקון זכוכית ואחריו 3 שעות של ייבוש בצנטריפוגת ואקום ב 4 ° C.
    הערה: מומלץ להוסיף זכוכית (ראה טבלת חומרים) במקום צינורות פלסטיק עקב כימיקלים תגובתיים מפלסטיק המשמשים לאורך שלב הפירוק הבא.
  5. יש להעביר את הדגימות המיובשות לשני שלבי דה-ריווטציה רצופים לצורך ניתוח GC-MS של המטבוליטים בסרום.
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים תחת מכסה אדים עקב סיכוני גירוי של הממסים.
    1. יש להשהות מחדש את תמציות הסרום המיובשות ב-30 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל מתוקסיאמין הידרוכלוריד (ראו טבלת חומרים) מומס בפירידין ולדגור עליו בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    2. נטרל דגימות עבור סילילציה של מטבוליטים עם 70 μL של N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoroacetamide (MTBSTFA, ראה טבלה של חומרים) ב 70 ° C במשך 1 שעות.
      הערה: מומלץ להשתמש במזרק זכוכית במקום בקצה פלסטיק בשלבים הבאים עקב ממיסי הפירוק המגיבים עם פלסטיק.

4. ניתוח מטבולומיקה באמצעות GC-MS

הערה: GC-MS מרובע יחיד (ראה טבלת חומרים) שימש למדידת המטבוליטים השונים בסרום, כולל פחמימות, חומצות אמינו ומתווכי מחזור TCA בדגימות שעברו דיבוע מווריד זולצר ומהחדר השמאלי. לחלופין, ניתן להשתמש בעמודות אחרות, אם כי הגדרות הניסוי כולל תוכנית הטמפרטורה עשויות להשתנות בהתאם לסוגי העמודות בהן נעשה שימוש.

  1. הזריקו 1 μL של הדגימה המפורקת ל-GC במצב מפוצל ב-280°C (טמפרטורת כניסה), תוך שימוש בהליום כגז נשא עם קצב זרימה של 1,500 מ"ל/דקה (נקודה מוגדרת).
  2. הגדר את המרובע ב- 200 ° C עם ממשק GC-MS ב- 300 ° C.
    הערה: תוכנית התנור עבור כל ניתוחי המטבוליטים מתחילה ב 60 ° C, מוחזקת במשך דקה אחת, ולאחר מכן מוגברת בקצב של 10 ° C / min עד הטמפרטורה מגיעה 320 ° C.
  3. אסוף נתונים על ידי יינון אלקטרונים (EI) המוגדר על 70 eV וקבל את נתוני הדגימה במצב סריקה (50-550 m/z)53. כל המטבוליטים ששימשו במחקר זה אומתו בעבר עם תקנים לאישור ספקטרום מסה וזמני שמירה.
  4. בצע אינטגרציה של אזור שיא באמצעות תוכנת ניתוח זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
  5. התאימו את התרכובות למכפלה של כל נגזרת TBMDS. לאחר מכן, השג את כרומטוגרמה יון החילוץ (EIC) על ידי שילוב ערך m/z של יון המקטע באזור השיא המתאים, ולאחר מכן יצא אותו. יוני שבר מוצגים בטבלה 1.
    הערה: ה-EIC של כל תרכובת נורמל על ידי זה של DL-norvaline בכל דגימה. הנתונים מיוצגים על ידי וריד Log2 Sulzer לחדר השמאלי (Log2(SV/LV)) באמצעות כל ערך EIC מנורמל.

תוצאות

איור 1 מדגים את סכמת הניסוי של מטבולומיקה AV ממוטבת BAT. כפי שהוזכר בסעיף הפרוטוקול, כדי להשיג רקמות שומן חום מגורה באופן דיפרנציאלי, עכברים עוברים אקלום טמפרטורה באמצעות אינקובטורים מכרסמים או מקבלים טיפול תרופתי כגון אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי. לאחר מכן, עכברים מורדמים, וד?...

Discussion

צעד קריטי בהבנת הפוטנציאל המטבולי של BAT במאזן האנרגיה של כל הגוף הוא להגדיר אילו חומרים מזינים הוא צורך, כיצד הם מעובדים מטבולית, ואילו מטבוליטים משתחררים למחזור הדם. פרוטוקול זה מציג טכניקת דגימה עורקית מיוחדת המאפשרת גישה לכלי הדם הוורידיים של BAT בין-סקפולרי וכלי דם עורקיים מערכתיים בעכ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לדווח עליהם.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי מעבדות צ'וי ויונג על הדיון המתודולוגי. אנו מודים ל- C. Jang ו- D. Guertin על העצה והמשוב. אנו מודים למ.ס. צ'וי על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי NRF-2022R1C1C1012034 ל- S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 ל-D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 ל- S.M.J. ו- D.W.C. עבודה זו נתמכה על-ידי האוניברסיטה הלאומית צ'ונגנם עבור W.T.K. איור 1 ואיור 2 נוצרו באמצעות BioRender (http://biorender.com/).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5-20 µL Filter TipsAxygenAX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"BD Biosciences309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)AgilentG7077B
Agilent 7693A AutosamplerAgilentG4513A
Agilent 8890 GC SystemAgilentG3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UIAgilent19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)AgilentG3335-90240
C57BL/6J mouseDBLC57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)LABCONCO 7811041
DL-NorvalineSigma-AldrichN7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430REppendorf5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30120086
Glass insert 250 μL Agilent5181-1270
Methanol (LC-MS grade)Sigma-AldrichQ34966-1L
Methoxyamine hydrochlorideSigma-Aldrich226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat baseSarstedt20.1290.100
MTBSTFASigma-Aldrich394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)Sigma-Aldrich270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum ConcentratorsLABCONCO 7310041
Rodent dietSAFESAFE R+40-10
Rodent incubatorPower scientificRIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"BD Biosciences328203
Vial Cap 9 mmAgilent5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mLAgilent5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40AxygenPCR-02-C

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE200BATBAT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved