Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Riepilogo

In questo protocollo, vengono descritti i metodi rilevanti per la metabolomica arterovenosa ottimizzata per BAT utilizzando GC-MS in un modello murino. Questi metodi consentono l'acquisizione di preziose informazioni sullo scambio di metaboliti mediati da BAT a livello di organismo.

Abstract

Il tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione dell'omeostasi metabolica attraverso un processo di dispendio energetico unico noto come termogenesi senza brividi. Per raggiungere questo obiettivo, BAT utilizza un menu diversificato di nutrienti circolanti per supportare la sua elevata domanda metabolica. Inoltre, BAT secerne fattori bioattivi derivati da metaboliti che possono fungere da combustibili metabolici o molecole di segnalazione, facilitando la comunicazione intratissutale e/o intertissutale mediata da BAT. Ciò suggerisce che BAT partecipi attivamente allo scambio sistemico di metaboliti, una caratteristica interessante che sta iniziando ad essere esplorata. Qui, introduciamo un protocollo per la metabolomica arterovenosa BAT ottimizzata a livello di topo in vivo . Il protocollo si concentra su metodi rilevanti per le stimolazioni termogeniche e su una tecnica di prelievo di sangue arterovenoso utilizzando la vena di Sulzer, che drena selettivamente il sangue venoso interscapolare derivato da BAT e il sangue arterioso sistemico. Successivamente, viene dimostrato un protocollo metabolomico basato sulla gascromatografia che utilizza quei campioni di sangue. L'uso di questa tecnica dovrebbe ampliare la comprensione dello scambio di metaboliti regolati dalle BAT a livello interorgano, misurando l'assorbimento netto e il rilascio di metaboliti da parte delle BAT.

Introduzione

Il tessuto adiposo bruno (BAT) possiede una proprietà unica di dispendio energetico nota come termogenesi non tremante (NST), che coinvolge sia i meccanismi dipendenti dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1) che quelli indipendenti da UCP1 1,2,3,4,5. Queste caratteristiche distintive implicano BAT nella regolazione del metabolismo sistemico e nella patogenesi delle malattie metaboliche, tra cui l'obesità, il diabete di tipo 2, le malattie cardi....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Sungkyunkwan (IACUC). I topi sono stati alloggiati in una struttura per animali approvata dalla IACUC situata in una camera bianca impostata a 22 °C e 45% di umidità, seguendo un ciclo giornaliero di luce/buio di 12 ore. Erano tenuti in rastrelliere ventilate e avevano accesso a una dieta standard ad libitum (comprendente il 60% di carboidrati, il 16% di proteine e il 3% di grassi). La lettiera e i materiali per la nidificazione sono stati cambiati su base settimanale. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J ....

Discussione

Un passo fondamentale per comprendere il potenziale metabolico del BAT nell'equilibrio energetico di tutto il corpo è definire quali nutrienti consuma, come vengono metabolicamente elaborati e quali metaboliti vengono rilasciati nella circolazione. Questo protocollo introduce una tecnica specializzata di campionamento arterovenoso che consente l'accesso alla vascolarizzazione venosa del BAT interscapolare e alla vascolarizzazione arteriosa sistemica nei topi C57BL/6J, che è stata recentemente sviluppata e convalidata d.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C