Métabolomique artérioveineuse pour mesurer l’échange de métabolites in vivo dans le tissu adipeux brun

Résumé

Dans ce protocole, les méthodes pertinentes pour la métabolomique artérioveineuse optimisée pour les MTD utilisant la GC-MS dans un modèle murin sont décrites. Ces méthodes permettent d’acquérir des informations précieuses sur l’échange de métabolites médié par les MTD au niveau de l’organisme.

Résumé

Le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle crucial dans la régulation de l’homéostasie métabolique grâce à un processus unique de dépense énergétique connu sous le nom de thermogenèse sans frisson. Pour y parvenir, BAT utilise un menu diversifié de nutriments circulants pour répondre à sa forte demande métabolique. De plus, la MTD sécrète des facteurs bioactifs dérivés de métabolites qui peuvent servir de carburants métaboliques ou de molécules de signalisation, facilitant la communication intratissulaire et/ou intertissulaire médiée par les MTD. Cela suggère que la MTD participe activement à l’échange systémique de métabolites, une caractéristique intéressante qui commence à être explorée. Ici, nous présentons un protocole pour la métabolomique artérioveineuse BAT optimisée in vivo au niveau de la souris. Le protocole se concentre sur des méthodes pertinentes pour les stimulations thermogéniques et une technique de prélèvement sanguin artérioveineux utilisant la veine de Sulzer, qui draine sélectivement le sang veineux interscapulaire dérivé de MTD et le sang artériel systémique. Ensuite, un protocole métabolomique basé sur la chromatographie en phase gazeuse utilisant ces échantillons de sang est démontré. L’utilisation de cette technique devrait permettre d’élargir la compréhension de l’échange de métabolites régulés par les MTD au niveau inter-organes en mesurant l’absorption et la libération nettes de métabolites par les MTD.

Introduction

Le tissu adipeux brun (MTD) possède une propriété unique de dépense énergétique connue sous le nom de thermogenèse sans frisson (NST), qui implique à la fois des mécanismes dépendants de la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1) et indépendants de l’UCP1 1,2,3,4,5. Ces caractéristiques distinctives impliquent la MTD dans la régulation du métabolisme systémique et la pathogenèse des maladies métaboliques, notamment l’obésité, le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la cachexie cancéreuse ^6,7,8. Des études rétrospectives récentes ont montré une association inverse entre la masse MTD et/ou son activité métabolique avec l’obésité, l’hyperglycémie et la santé cardiométabolique chez l’homme ^9,10,11.

Récemment, la MTD a été proposée comme un puits métabolique responsable du maintien de la NST, car elle nécessite des quantités substantielles de nutriments circulants comme carburant thermogénique ^6,7. De plus, la MTD peut générer et libérer des facteurs bioactifs, appelés adipokines brunes ou BATokines, qui agissent comme des signaux endocriniens et/ou paracrines, indiquant son implication active dans l’homéostasie métabolique au niveau des systèmes 12,13,14,15. Par conséquent, la compréhension du métabolisme des nutriments de la MTD devrait améliorer notre compréhension de sa signification physiopathologique chez l’homme, au-delà de son rôle conventionnel en tant qu’organe thermorégulateur.

Des études métabolomiques utilisant des traceurs d’isotopes stables, en combinaison avec des études classiques d’absorption des nutriments utilisant des radiotraceurs non métabolisables, ont considérablement amélioré notre compréhension des nutriments qui sont préférentiellement absorbés par les MTD et de la manière dont ils sont utilisés 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^,26,27. Par exemple, des études de traceurs radioactifs ont démontré que les MTD activés par le froid absorbent le glucose, les acides gras liés aux lipoprotéines et les acides aminés à chaîne ramifiée 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Le traçage isotopique récent combiné à des études métabolomiques nous a permis de mesurer le devenir métabolique et le flux de ces nutriments dans les tissus et les cellules en culture 24,25,26,28,29,30. Cependant, ces analyses se concentrent principalement sur l’utilisation individuelle des nutriments, ce qui nous laisse avec une connaissance limitée des rôles systémiques des MTD dans l’échange de métabolites organiques. Les questions concernant la série spécifique de nutriments circulants consommés par les MTD et leurs contributions quantitatives en termes de carbone et d’azote restent insaisissables. De plus, l’exploration de la capacité de la MTD à générer et à libérer des BATokines dérivées de métabolites (par exemple, des lipokines) à l’aide de nutriments ne fait que commencer 12,13,14,15,31,32.

L’analyse sanguine artérioveineuse est une approche physiologique classique utilisée pour évaluer l’absorption ou la libération spécifique de molécules circulantes dans les organes/tissus. Cette technique a déjà été appliquée à la MTD interscapulaire de rats pour mesurer l’oxygène et plusieurs métabolites, établissant ainsi la MTD comme le site majeur de la thermogenèse adaptative avec son potentiel catabolique 33,34,35,36,37. Récemment, une étude artérioveineuse utilisant la MTD interscapulaire de rat a été couplée à une approche transomique, conduisant à l’identification de BATokines non découvertes libérées par la MTD³⁸ stimulée thermiquement.

Les progrès récents de la métabolomique basée sur la chromatographie en phase gazeuse à haute sensibilité et la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (GC-MS et LC-MS) ont ravivé l’intérêt pour les études artérioveineuses pour l’analyse quantitative de l’échange de métabolites spécifiques à un organe 39,40,41. Ces techniques, avec leur pouvoir de résolution élevé et leur précision de masse, permettent l’analyse complète d’une large gamme de métabolites à partir de petites quantités d’échantillons.

Dans le cadre de ces avancées, une étude récente a réussi à adapter la métabolomique artérioveineuse à l’étude de la MTD au niveau de la souris, permettant l’analyse quantitative des activités d’échange de métabolites dans la MTD dans différentes conditions⁴². Cet article présente un protocole de métabolomique artérioveineuse ciblant les MTD en utilisant la GC-MS dans un modèle murin C57BL/6J.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Sungkyunkwan (IACUC). Les souris ont été hébergées dans une animalerie approuvée par l’IACUC, située dans une salle blanche réglée à 22 °C et 45 % d’humidité, après un cycle jour/lumière de 12 heures. Ils ont été gardés dans des racks ventilés et ont eu accès à un régime alimentaire standard ad libitum (comprenant 60 % de glucides, 16 % de protéines et 3 % de matières grasses). La litière et le matériel de nidification ont été changés chaque semaine. Pour cette étude, des souris mâles C57BL/6J âgées de 12 semaines et pesant entre 25 g et 30 g ont été utilisées. Ces animaux provenaient d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux).

1. Modulation de l’activité métabolique du tissu adipeux brun par acclimatation à la température et stimulation pharmacologique

REMARQUE : L’acclimatation à la température sur plusieurs jours ou semaines ou la stimulation pharmacologique à l’aide d’agonistes des récepteurs β-adrénergiques sont des méthodes couramment utilisées pour moduler l’activité des MTD¹. Par conséquent, un aperçu concis de la méthode est fourni ci-dessous pour permettre aux lecteurs de choisir l’approche appropriée selon les besoins. Pour obtenir une MTD métaboliquement inactive (moins thermogénique), une température chaude de base, appelée thermoneutralité (28-30 °C), est sélectionnée pour les souris C57BL/6J. Cette plage garantit que les souris n’ont pas besoin de dépenser de l’énergie supplémentaire pour maintenir une température corporelle constante. Pour obtenir des MTD métaboliquement modestes ou très actives (thermogéniques), il est possible de choisir des températures froides douces (20-22 °C) ou très froides (6 °C). Pour les besoins de cette expérience, des souris ont été élevées dans des conditions de logement standard à 22 °C, qui, bien que légèrement froides pour les souris, n’ont impliqué aucune stimulation pharmacologique.

1. Acclimatation à la température
   1. Séparez les souris pour qu’elles abritent 1 ou 2 souris par cage au moins 1 semaine avant le début de l’acclimatation à la température. Préparez des incubateurs de rongeurs équipés d’un système de ventilation de l’air, de contrôle de la température et de l’humidité dans les conditions souhaitées.
   2. Déplacez les cages dans leurs incubateurs de rongeurs respectifs aux jours appropriés pour le type d’acclimatation à la température choisi.
   3. Assurez-vous que la répartition du nombre de souris est égale dans tous les groupes, avec 1 ou 2 souris par cage. Le logement individuel est préféré car il est plus sensible aux changements physiologiques induits par la température que le logement de groupe⁴³. Voici les conditions d’hébergement spécifiques à chaque groupe :
      1. Groupe de thermoneutralité (30 °C) : Maintenez les souris de ce groupe en continu à une température de 30 °C pendant quatre semaines maximum.
      2. Groupe de froid sévère : Dans un premier temps, logez les souris de ce groupe à 18 °C sans aucun matériel de nidification. Ils connaîtront une diminution progressive de la température hebdomadaire, atteignant 6 °C à la quatrième semaine. La progression de la température est la suivante : 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Groupe à froid doux (20-22 °C) : Hébergez les souris de ce groupe dans des incubateurs pour rongeurs dans les mêmes conditions que les conditions de logement standard mentionnées précédemment.
      4. Défis de froid aigu : Pour les défis de froid aigu, placez 1 à 2 souris par cage sans aucun matériel de nidification et exposez-les à un incubateur de rongeurs réglé à 6 °C pendant 8 h maximum.
         REMARQUE : Ces conditions de logement et les variations de température sont essentielles pour étudier les effets de différents environnements de température sur l’activité et le métabolisme des MTD.
   4. Changez les cages et faites le plein de nourriture et d’eau chaque semaine. Pré-acclimater les cages au moins 24 h avant la supplémentation, à leur température respective (incubateur de rongeurs).
      REMARQUE : Pour éviter de perturber le stimulus de température approprié, il est important de ne pas fournir d’enrichissements de souris qui pourraient conduire à la construction de nids. En réponse à un froid intense, les souris dépensent plus d’énergie pour maintenir la température corporelle, ce qui entraîne une augmentation de l’apport alimentaire et des taux d’excrétion plus élevés. Par conséquent, il est crucial de vérifier les cages au moins deux à trois fois par semaine (en suivant les directives institutionnelles locales) pour s’assurer que les souris disposent d’un approvisionnement suffisant en nourriture et en eau, et que les cages ne sont pas excessivement humides. Cette surveillance est essentielle pour maintenir le bien-être et la santé des souris pendant l’étude.
2. Stimulation pharmacologique¹ à l’aide de l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques CL316,243
   1. Pour maximiser l’effet stimulant, pré-logez les souris à la thermoneutralité (30 °C) pendant 2 à 4 semaines avant les injections.
   2. Après la période d’acclimatation, injecter par voie intrapéritonéale 1 mg/kg CL316,243.
      REMARQUE : Pour la stimulation chronique avec l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques (par exemple de 3 jours à la semaine ^1,44,45), des injections quotidiennes sont nécessaires en raison de la stabilité du médicament. Le CL316,243 dilué doit être préparé le jour de l’injection en raison de sa stabilité.

2. Prélèvement sanguin artérioveineux

REMARQUE : Les souris de plus de 12 à 14 semaines sont recommandées pour les prélèvements sanguins artérioveineux. Les souris plus jeunes peuvent ne pas avoir des veines de Sulzer suffisamment dimensionnées, un vaisseau sanguin distinct qui draine spécifiquement le sang veineux de l’interscapulaire BAT⁴⁶.

1. Anesthésiez doucement à l’aide du vaporisateur calibré avec 3 % d’isoflurane pour l’induction (dans une chambre de 205 x 265 x 200 mm) et 2 % d’isoflurane pour l’entretien (avec un masque d’anesthésie gazeuse).
   REMARQUE : L’ensemble de la procédure de prélèvement sanguin artérioveineux doit être effectué rapidement après l’anesthésie. Un coussin chauffant chauffé à l’eau peut être utilisé pendant l’anesthésie pour maintenir la température corporelle centrale.
   ATTENTION : L’isoflurane est très volatil et toxique lorsqu’il est inhalé. Par conséquent, l’anesthésie primaire doit être effectuée sous une hotte.
2. Vérifiez les réflexes de l’animal, comme la rétraction de la patte, pour confirmer que l’anesthésie a atteint une profondeur appropriée.
3. Collecte de sang veineux dans la veine de Sulzer
   1. Positionnez la souris de manière à exposer la peau dorsale, confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement des orteils juste avant de faire l’incision. Humidifiez la peau dorsale avec suffisamment d’éthanol à 70 % pour éviter le décollement des poils et faites une incision le long du dos de la partie inférieure du thorax jusqu’au cou.
      REMARQUE : La MTD interscapulaire est située juste sous la peau, composée de deux coussinets adipeux recouverts de minces tissus adipeux blancs. Il est important de s’assurer que la souris reste sous anesthésie à travers le masque d’anesthésie gazeuse.
   2. Soulevez doucement la MTD interscapulaire à l’aide d’une pince à pointe pliée et coupez soigneusement les tissus attachés, dont la plupart sont des muscles. Soulevez le coussinet adipeux vers la tête, continuez à couper les tissus attachés et ouvrez soigneusement la région jusqu’à ce que la veine de Sulzer (un grand vaisseau rouge foncé en forme de « Y » relié aux deux coussinets adipeux de la MTD interscapulaire) soit exposée.
      REMARQUE : Veillez à ne pas couper les vaisseaux capillaires des tissus musculaires qui sont connectés à la région frontale et latérale de la MTD interscapulaire, car cela réduirait considérablement la quantité et la qualité du sang qui s’écoule de la veine de Sulzer.
   3. Coupez soigneusement la veine de Sulzer et prélevez environ 40 μL de sang à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL et d’une pipette P100. Conservez le sang dans un tube de prélèvement sanguin et conservez le tube sur de la glace jusqu’au processus de prélèvement de sérum.
      REMARQUE : Il est important de prélever du sang juste en dessous du point de division en forme de Y de la veine de Sulzer, afin d’éviter la contamination du sang par la veine cave supérieure⁴⁷. Recueillir trop de sang diminuera les caractéristiques de la veine de Sulzer. Ainsi, assurez-vous de prélever la quantité minimale de sang nécessaire dans la veine de Sulzer pour l’analyse. Soyez prudent lors de la sélection des tubes de prélèvement sanguin, car le sérum et le plasma donnent des profils de métabolites différents 48,49,50. Pour le prélèvement de plasma, il est nécessaire d’utiliser des tubes recouverts d’héparine. Dans cette expérience, des tubes recouverts d’un activateur de coagulation ont été choisis pour obtenir le sérum. En aucun cas, des tubes revêtus d’EDTA ne doivent être utilisés, car l’EDTA a un impact significatif sur les signaux de spectrométrie de masse^51,52.
4. Collecte de sang artériel dans le ventricule gauche
   1. Retournez la souris sans perdre le contact avec le cône nasal, pour exposer la peau ventrale. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement de l’orteil avant de faire l’incision. Humidifiez la peau ventrale avec une quantité suffisante d’éthanol à 70 % pour éviter le décollement des poils, et ouvrez soigneusement la cavité thoracique avec des ciseaux pour exposer le cœur sans endommager la structure interne.
   2. Ponctionner avec précision la zone apex du ventricule gauche à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de 29 G (1/2 po). Insérez les deux tiers d’une aiguille de 1/2 po à une distance de 3 à 5 mm à l’horizontale droite de l’apex du cœur (Figure 1B) et tirez la seringue vers l’arrière pour recueillir le sang du ventricule gauche (50 à 100 μL). Le sang du ventricule gauche est du sang artériel oxygéné qui est rouge vif. Conservez le sang dans un tube de prélèvement sanguin et conservez le tube sur de la glace jusqu’au processus de prélèvement de sérum.
      REMARQUE : Une incision minimale doit être pratiquée dans la cavité thoracique pour accéder au cœur. Une incision excessive peut entraîner des saignements locaux, qui peuvent par la suite entraîner une pression artérielle basse. Cela pourrait affecter la qualité du sang artériel recueilli dans le ventricule gauche. Évitez de faire pivoter ou de retourner le cœur, car il sera difficile de déterminer la position précise du ventricule gauche.
   3. Pratiquer l’euthanasie et l’assurer avec une méthode appropriée en suivant les directives des institutions locales. Par exemple, l’euthanasie peut être pratiquée par luxation cervicale et confirmée par l’arrêt des battements cardiaques.
5. Centrifuger des échantillons de sang à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. Le surnageant doit contenir du sérum ou du plasma, selon le type de tube de prélèvement sanguin utilisé. On peut s’arrêter ici et stocker les échantillons à -20 °C jusqu’au traitement du sérum pour l’analyse GC-MS.
   REMARQUE : Une hémolyse peut s’être produite si un surnageant de couleur rouge est observé. Pour éviter l’hémolyse, faites vortex l’échantillon avant la fin de la coagulation. Certains métabolites enrichis en globules rouges, notamment la glutamine et le lactate, pourraient entraîner une mauvaise interprétation des données, bien que la plupart des métabolites ne soient pas affectés de manière significative par l’hémolyse. Il est recommandé d’analyser le sérum/plasma dans un délai d’une semaine.

3. Extraction des métabolites à partir du sérum et de la dérivation chimique

1. Préparation à l’extraction
   NOTE : Toutes les méthodes, y compris l’extraction des métabolites, la dérivation et l’analyse des données, sont des versions légèrement modifiées des méthodes décrites précédemment^53,54.
   1. Préparer le tampon d’extraction en ajoutant une solution de 100 μM de DL-norvaline, étalon interne (voir le tableau des matériaux), au méthanol de qualité MS.
   2. S’assurer que toutes les procédures expérimentales sont effectuées sur la glace.
2. Transférez 10 μL de sérum de souris extrait de la veine de Sulzer ou du ventricule gauche dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 40 μL de tampon d’extraction.
3. Pour éliminer les débris cellulaires et les protéines, faites un bref vortex dans les échantillons de sérum, puis centrifugez à la vitesse maximale (18 000 x g) pendant 30 minutes à 4 °C.
4. Après centrifugation, transférer délicatement 40 μL de surnageant dans un flacon en verre suivi de 3 h de séchage dans une centrifugeuse sous vide à 4 °C.
   REMARQUE : Un insert en verre (voir le tableau des matériaux) est recommandé au lieu de tubes en plastique en raison des produits chimiques réactifs au plastique utilisés tout au long de l’étape de dérivation suivante.
5. Soumettre les échantillons séchés à deux étapes consécutives de dérivatisation pour l’analyse GC-MS des métabolites sériques.
   REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte en raison des risques d’irritation des solvants.
   1. Remettre en suspension les extraits de sérum séché dans 30 μL de chlorhydrate de méthoxyamine à 10 mg/mL (voir tableau des matériaux) dissous dans de la pyridine et incuber à 37 °C pendant 30 min.
   2. Dérivation d’échantillons pour la silylation des métabolites avec 70 μL de N-méthyl-N-tert-butyldiméthylsilylrifluoroacétamide (MTBSTFA, voir Tableau des matériaux) à 70 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une seringue en verre plutôt qu’un embout en plastique dans les étapes suivantes en raison des solvants de dérivation qui réagissent avec le plastique.

4. Analyse métabolomique par GC-MS

NOTA : La GC-MS quadruple simple (voir le tableau des matériaux) a été utilisée pour mesurer les divers métabolites sériques, y compris les glucides, les acides aminés et les intermédiaires du cycle du TCA, dans des échantillons dérivatisés de la veine de Sulzer et du ventricule gauche. D’autres colonnes peuvent également être utilisées, bien que les paramètres expérimentaux, y compris le programme de température, puissent varier en fonction des types de colonnes utilisés.

1. Injecter 1 μL de l’échantillon dérivé dans le GC en mode splitless à 280 °C (température d’entrée), en utilisant l’hélium comme gaz vecteur avec un débit de 1.500 mL/min (point de consigne).
2. Réglez le quadripôle à 200 °C avec l’interface GC-MS à 300 °C.
   REMARQUE : Le programme de l’étuve pour toutes les analyses de métabolites commence à 60 °C, est maintenu pendant 1 min, puis est augmenté à un taux de 10 °C / min jusqu’à ce que la température atteigne 320 °C.
3. Collectez des données par ionisation électronique (EI) réglée à 70 eV et acquérez les données de l’échantillon en mode balayage (50-550 m/z)⁵³. Tous les métabolites utilisés dans cette étude ont été préalablement validés à l’aide d’étalons pour confirmer les spectres de masse et les temps de rétention.
4. Effectuez l’intégration de la zone de pointe à l’aide d’un logiciel d’analyse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
5. Faites correspondre les composés avec l’ion produit de chaque dérivé de TBMDS. Ensuite, obtenez le chromatogramme d’ions d’extraction (EIC) en intégrant la valeur m/z de l’ion fragment dans la zone de pic correspondante, puis exportez-le. Les ions fragments sont indiqués dans le tableau 1.
   NOTA : L’EIC de chaque composé a été normalisé par celui de la DL-norvaline dans chaque échantillon. Les données sont représentées par Log₂ de la veine de Sulzer jusqu’au ventricule gauche (Log₂(SV/LV)) en utilisant chaque valeur EIC normalisée.

Résultats

La figure 1 illustre le schéma expérimental de la métabolomique AV optimisée pour les MTD. Comme mentionné dans la section Protocole, pour obtenir des tissus adipeux bruns stimulés de manière différentielle, les souris subissent une acclimatation à la température à l’aide d’incubateurs pour rongeurs ou reçoivent une administration pharmacologique telle que des agonistes des récepteurs β-adrénergiques. Par la suite, les souris sont anesthésiées et des échantillons de san...

Discussion

Une étape essentielle pour comprendre le potentiel métabolique de la MTD dans l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps consiste à définir les nutriments qu’elle consomme, comment ils sont métaboliques et quels métabolites sont libérés dans la circulation. Ce protocole introduit une technique spécialisée de prélèvement artérioveineux qui permet d’accéder à la vascularisation veineuse de la MTD interscapulaire et à la vascularisation artérielle systémique chez les souris C57BL/6J, qui a ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C