Metabolómica arteriovenosa para medir el intercambio de metabolitos in vivo en tejido adiposo marrón

Resumen

En este protocolo, se describen los métodos relevantes para la metabolómica arteriovenosa optimizada para BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón. Estos métodos permiten la adquisición de información valiosa sobre el intercambio de metabolitos mediado por MTD a nivel de organismo.

Resumen

El tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la homeostasis metabólica a través de un proceso único de gasto de energía conocido como termogénesis sin escalofríos. Para lograr esto, BAT utiliza un menú diverso de nutrientes circulantes para respaldar su alta demanda metabólica. Además, las MTD secretan factores bioactivos derivados de metabolitos que pueden servir como combustibles metabólicos o moléculas de señalización, lo que facilita la comunicación intratisular y/o intertisular mediada por BAT. Esto sugiere que las MTD participan activamente en el intercambio sistémico de metabolitos, una característica interesante que está empezando a ser explorada. Aquí, presentamos un protocolo para la metabolómica arteriovenosa de MTD optimizada in vivo a nivel de ratón. El protocolo se centra en métodos relevantes para las estimulaciones termogénicas y una técnica de muestreo de sangre arteriovenosa utilizando la vena de Sulzer, que drena selectivamente la sangre venosa derivada de BAT interescapular y la sangre arterial sistémica. A continuación, se demuestra un protocolo metabolómico basado en cromatografía de gases utilizando esas muestras de sangre. El uso de esta técnica debería ampliar la comprensión del intercambio de metabolitos regulado por MTD a nivel interorgánico mediante la medición de la absorción y liberación neta de metabolitos por las MTD.

Introducción

El tejido adiposo marrón (BAT) posee una propiedad única de gasto energético conocida como termogénesis sin temblores (NST), que involucra mecanismos dependientes de la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1) e independientes de UCP1 1,2,3,4,5. Estas características distintivas implican a las MTD en la regulación del metabolismo sistémico y la patogénesis de las enfermedades metabólicas, como la obesidad, la diabetes tipo 2, las enfermedades cardiovasculares y la caquexia por cáncer ^6,7,8. Estudios retrospectivos recientes han demostrado una asociación inversa entre la masa MTD y/o su actividad metabólica con la obesidad, la hiperglucemia y la salud cardiometabólica en humanos ^9,10,11.

Recientemente, la MTD ha sido propuesta como un sumidero metabólico responsable del mantenimiento de la TSN, ya que requiere cantidades sustanciales de nutrientes circulantes como combustible termogénico ^6,7. Además, la MTD puede generar y liberar factores bioactivos, denominados adipocinas marrones o BATokinas, que actúan como señales endocrinas y/o paracrinas, lo que indica su participación activa en la homeostasis metabólica a nivel de sistemas 12,13,14,15. Por lo tanto, comprender el metabolismo de los nutrientes de BAT debería mejorar nuestra comprensión de su importancia fisiopatológica en los seres humanos, más allá de su papel convencional como órgano termorregulador.

Los estudios metabolómicos en los que se emplean trazadores de isótopos estables, en combinación con los estudios clásicos de absorción de nutrientes en los que se utilizan radiotrazadores no metabolizables, han mejorado significativamente nuestra comprensión de qué nutrientes son absorbidos preferentemente por las MTD y cómo se utilizan 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^,26,27. Por ejemplo, los estudios de trazadores radiactivos han demostrado que la MTD activada por frío absorbe glucosa, ácidos grasos unidos a lipoproteínas y aminoácidos de cadena ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27. El rastreo de isótopos reciente combinado con estudios metabolómicos nos ha permitido medir el destino metabólico y el flujo de estos nutrientes dentro de los tejidos y células cultivadas 24,25,26,28,29,30. Sin embargo, estos análisis se centran principalmente en la utilización individual de nutrientes, lo que nos deja con un conocimiento limitado de las funciones de los sistemas BAT en el intercambio de metabolitos de órganos. Las cuestiones relativas a la serie específica de nutrientes circulantes consumidos por las MTD y sus contribuciones cuantitativas en términos de carbono y nitrógeno siguen siendo difíciles de alcanzar. Además, la exploración de si las MTD pueden generar y liberar BATokines derivadas de metabolitos (por ejemplo, lipocinas) utilizando nutrientes^{apenas está comenzando} 12,13,14,15,31,32.

El análisis de sangre arteriovenosa es un enfoque fisiológico clásico que se utiliza para evaluar la captación o liberación específica de moléculas circulantes en órganos/tejidos. Esta técnica se ha aplicado previamente a la MTD interescapular de ratas para medir el oxígeno y varios metabolitos, estableciendo así la MTD como el principal sitio de termogénesis adaptativa con su potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recientemente, un estudio arteriovenoso en el que se utilizaron MTD interescapulares de rata se combinó con un enfoque transómico, lo que condujo a la identificación de BATokines no descubiertos liberados por la MTD³⁸ estimulada termogénicamente.

Los avances recientes en la metabolómica basada en cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta sensibilidad basada en espectrometría de masas (GC-MS y LC-MS) han reavivado el interés en los estudios arteriovenosos para el análisis cuantitativo del intercambio de metabolitos específicos de órganos 39,40,41. Estas técnicas, con su alto poder de resolución y precisión de masa, permiten el análisis exhaustivo de una amplia gama de metabolitos utilizando pequeñas cantidades de muestra.

En consonancia con estos avances, un estudio reciente adaptó con éxito la metabolómica arteriovenosa para estudiar las MTD a nivel de ratón, lo que permitió el análisis cuantitativo de las actividades de intercambio de metabolitos en las MTD en diferentes condiciones⁴². En este artículo se presenta un protocolo de metabolómica arteriovenosa dirigido a BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón C57BL/6J.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan. Los ratones se alojaron en una instalación de animales aprobada por la IACUC ubicada en una sala limpia a 22 °C y 45% de humedad, siguiendo un ciclo diario de luz/oscuridad de 12 h. Se mantuvieron en estantes ventilados y tuvieron acceso a una dieta estándar de comida ad libitum (que comprendía 60% de carbohidratos, 16% de proteínas y 3% de grasas). La ropa de cama y los materiales de anidación se cambiaron semanalmente. Para este estudio, se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 12 semanas de edad y con un peso de entre 25 g y 30 g. Estos animales se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Modulación de la actividad metabólica del tejido adiposo marrón a través de la aclimatación a la temperatura y la estimulación farmacológica

NOTA: La aclimatación a la temperatura durante varios días o semanas o la estimulación farmacológica con agonistas de los receptores β-adrenérgicos son métodos comúnmente empleados para modular la actividad MTD¹. Por lo tanto, a continuación se proporciona una descripción general concisa del método para que los lectores puedan elegir el enfoque apropiado según sea necesario. Para obtener MTD metabólicamente inactiva (menos termogénica), se selecciona una temperatura cálida de referencia, denominada termoneutralidad (28-30 °C), para los ratones C57BL/6J. Este rango garantiza que los ratones no necesiten gastar energía adicional para mantener una temperatura corporal constante. Para obtener MTD metabólicamente modesta o altamente activa (termogénica), se pueden elegir temperaturas de frío suave (20-22 °C) o de frío severo (6 °C), respectivamente. Para los fines de este experimento, los ratones se criaron en condiciones de alojamiento estándar a 22 °C, que, aunque ligeramente frías para los ratones, no implicaron ninguna estimulación farmacológica.

1. Aclimatación a la temperatura
   1. Separe los ratones para albergar 1 o 2 ratones por jaula al menos 1 semana antes de comenzar la aclimatación a la temperatura. Prepare incubadoras de roedores equipadas con ventilación de aire, control de temperatura y humedad con las condiciones deseadas.
   2. Mueva las jaulas a sus respectivas incubadoras de roedores en días apropiados para el tipo de aclimatación a la temperatura elegida.
   3. Asegúrese de que la distribución del número de ratones sea uniforme en todos los grupos, con 1 o 2 ratones por jaula. Se prefiere el alojamiento individual, ya que es más sensible a los cambios fisiológicos inducidos por la temperatura en comparación con el alojamiento grupal⁴³. Estas son las condiciones específicas de alojamiento para cada grupo:
      1. Grupo de termoneutralidad (30 °C): Mantener a los ratones de este grupo de forma continua a una temperatura de 30 °C durante un máximo de cuatro semanas.
      2. Grupo frío severo: Inicialmente, aloje a los ratones de este grupo a 18 °C sin ningún material de anidación. Experimentarán un descenso gradual de la temperatura semanal, alcanzando los 6 °C en la cuarta semana. La progresión de la temperatura es la siguiente: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Grupo frío suave (20-22 °C): Aloje a los ratones de este grupo en incubadoras de roedores en las mismas condiciones que las condiciones de alojamiento estándar mencionadas anteriormente.
      4. Desafíos de frío agudo: Para desafíos de frío agudo, coloque 1-2 ratones por jaula sin ningún material de anidación y expóngalos a una incubadora de roedores configurada a 6 ° C durante un máximo de 8 h.
         NOTA: Estas condiciones de alojamiento y variaciones de temperatura son esenciales para estudiar los efectos de diferentes entornos de temperatura sobre la actividad y el metabolismo de las MTD.
   4. Cambie las jaulas y reponga la comida y el agua cada semana. Aclimatar previamente las jaulas al menos 24 h antes de la suplementación, a su temperatura respectiva (incubadora de roedores).
      NOTA: Para evitar la perturbación del estímulo de temperatura adecuado, es importante no proporcionar enriquecimiento de ratones que pueda conducir a la construcción de nidos. En respuesta al frío intenso, los ratones gastan más energía para mantener la temperatura corporal, lo que resulta en un aumento de la ingesta de alimentos y mayores tasas de excreción. Por lo tanto, es crucial revisar las jaulas al menos dos o tres veces por semana (siguiendo las pautas institucionales locales) para asegurarse de que los ratones tengan un suministro adecuado de comida y agua, y que las jaulas no estén excesivamente mojadas. Este seguimiento es esencial para mantener el bienestar y la salud de los ratones durante el estudio.
2. Estimulación farmacológica¹ con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL316,243
   1. Para maximizar el efecto estimulante, coloque previamente a los ratones en termoneutralidad (30 °C) durante 2-4 semanas antes de las inyecciones.
   2. Después del período de aclimatación, inyectar por vía intraperitoneal 1 mg/kg CL316,243.
      NOTA: Para la estimulación crónica con el agonista del receptor β3-adrenérgico (por ejemplo, desde los 3 días hasta las semanas ^1,44,45), se requieren inyecciones diarias debido a la estabilidad del fármaco. El CL316,243 diluido debe prepararse el día de la inyección debido a la estabilidad.

2. Toma de muestras de sangre arteriovenosa

NOTA: Los ratones de más de 12 a 14 semanas son los más recomendados para la toma de muestras de sangre arteriovenosa. Es posible que los ratones más jóvenes no tengan las venas de Sulzer de tamaño suficiente, un vaso sanguíneo distinto que drena específicamente la sangre venosa del BAT⁴⁶ interescapular.

1. Anestesiar suavemente con el vaporizador calibrado con un 3% de isoflurano para la inducción (en una cámara de 205 x 265 x 200 mm) y un 2% de isoflurano para el mantenimiento (con una máscara de anestesia de gas).
   NOTA: Todo el procedimiento de muestreo de sangre arteriovenosa debe realizarse de inmediato después de la anestesia. Se puede usar una almohadilla térmica calentada con agua durante la anestesia para mantener la temperatura corporal central.
   PRECAUCIÓN: El isoflurano es altamente volátil y tóxico cuando se inhala. Por lo tanto, la anestesia primaria debe realizarse bajo una campana extractora.
2. Verifique los reflejos del animal, como la retracción de las patas, para confirmar que la anestesia ha alcanzado una profundidad adecuada.
3. Extracción de sangre venosa de la vena del Sulzer
   1. Coloque el ratón para exponer la piel dorsal, confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie justo antes de realizar la incisión. Humedece la piel dorsal con una gran cantidad de etanol al 70% para evitar el desprendimiento del cabello y haz una incisión a lo largo de la espalda desde la parte inferior del tórax hasta el cuello.
      NOTA: La MTD interescapular se encuentra justo debajo de la piel, y consiste en dos almohadillas de grasa cubiertas por finos tejidos adiposos blancos. Es importante asegurarse de que el ratón permanezca bajo anestesia a través de la máscara de anestesia de gas.
   2. Levante suavemente la MTD interescapular con pinzas de punta doblada y corte con cuidado los tejidos adheridos, la mayoría de los cuales son músculos. Levante la almohadilla de grasa hacia la cabeza, continúe cortando los tejidos adheridos y abra con cuidado la región hasta que la vena de Sulzer (un gran vaso de color rojo oscuro en forma de "Y" conectado a ambas almohadillas de grasa del BAT interescapular) quede expuesta.
      NOTA: Tenga cuidado de no cortar los vasos capilares de los tejidos musculares que están conectados con la región frontal y lateral de la BAT interescapular, ya que al hacerlo se reducirá significativamente la cantidad y la calidad de la sangre que drena de la vena de Sulzer.
   3. Cortar con cuidado la vena de Sulzer y recoger aproximadamente 40 μl de sangre con puntas de pipeta de 200 μl y una pipeta P100. Guarde la sangre en un tubo de extracción de sangre y manténgalo en hielo hasta el proceso de recolección de suero.
      NOTA: Es importante recolectar sangre justo debajo del punto de división en forma de Y de la vena de Sulzer, para evitar la contaminación de la sangre de la vena cava superior⁴⁷. Recolectar demasiada sangre disminuirá las características de la vena de Sulzer. Por lo tanto, asegúrese de recolectar la cantidad mínima de sangre necesaria de la vena de Sulzer para su análisis. Tenga cuidado al seleccionar los tubos de extracción de sangre, ya que el suero y el plasma producen diferentes perfiles de metabolitos 48,49,50. Para la recolección de plasma, es necesario utilizar tubos recubiertos de heparina. En este experimento, se eligieron tubos recubiertos de activadores de coagulación para obtener suero. Bajo ninguna circunstancia se deben utilizar tubos recubiertos de EDTA, ya que el EDTA afecta significativamente las señales de espectrometría de masas^51,52.
4. Extracción de sangre arterial del ventrículo izquierdo
   1. Voltee el mouse sin perder el contacto con el cono de la nariz, para exponer la piel ventral. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie antes de realizar la incisión. Humedecer la piel ventral con una gran cantidad de etanol al 70% para evitar el desprendimiento del cabello y abrir cuidadosamente la cavidad torácica con unas tijeras para exponer el corazón sin dañar ninguna estructura interna.
   2. Perforar con precisión el área del ápice del ventrículo izquierdo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 29 G (1/2"). Inserte dos tercios de una aguja de 1/2 pulgada a 3-5 mm de la horizontal derecha del ápice del corazón (Figura 1B) y tire de la jeringa hacia atrás para recoger sangre del ventrículo izquierdo (50-100 μL). La sangre del ventrículo izquierdo es sangre arterial oxigenada de color rojo brillante. Guarde la sangre en un tubo de extracción de sangre y manténgalo en hielo hasta el proceso de recolección de suero.
      NOTA: Se debe hacer una incisión mínima en la cavidad torácica para acceder al corazón. Una incisión excesiva podría provocar una hemorragia local, que posteriormente puede provocar una presión arterial baja. Esto podría afectar la calidad de la sangre arterial extraída del ventrículo izquierdo. Evite rotar o voltear el corazón, ya que dificultará la determinación de la posición precisa del ventrículo izquierdo.
   3. Realizar la eutanasia y asegurarla con un método adecuado siguiendo las directrices de las instituciones locales. Por ejemplo, la eutanasia puede realizarse a través de la luxación cervical y confirmarse mediante el cese de los latidos del corazón.
5. Centrifugar muestras de sangre a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. El sobrenadante debe contener suero o plasma, dependiendo del tipo de tubo de extracción de sangre utilizado. Se puede parar aquí y almacenar las muestras a -20 °C hasta el procesamiento del suero para el análisis de GC-MS.
   NOTA: Es posible que se haya producido hemólisis si se observa un sobrenadante de color rojo. Para evitar la hemólisis, haga un vórtice de la muestra antes de que se complete la coagulación. Algunos metabolitos enriquecidos con glóbulos rojos, como la glutamina y el lactato, podrían dar lugar a una interpretación errónea de los datos, aunque es posible que la mayoría de los metabolitos no se vean afectados significativamente por la hemólisis. Se recomienda analizar el suero/plasma en el plazo de una semana.

3. Extracción de metabolitos a partir de suero y derivatización química

1. Preparación para la extracción
   NOTA: Todos los métodos, incluida la extracción de metabolitos, la derivatización y el análisis de datos, son versiones ligeramente modificadas de los métodos descritos anteriormente^53,54.
   1. Prepare el tampón de extracción añadiendo 100 μM de solución de DL-norvalina, patrón interno (véase la tabla de materiales), al metanol de grado MS.
   2. Asegúrese de que todos los procedimientos experimentales se lleven a cabo en hielo.
2. Transfiera 10 μl de suero de ratón extraído de la vena de Sulzer o del ventrículo izquierdo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 40 μl de tampón de extracción.
3. Para eliminar los restos celulares y las proteínas, se deben realizar un vórtice breve de las muestras de suero, seguido de la centrifugación a la velocidad máxima (18.000 x g) durante 30 minutos a 4 °C.
4. Después de la centrifugación, transfiera cuidadosamente 40 μL de sobrenadante a un vial de vidrio seguido de 3 h de secado en una centrífuga al vacío a 4 °C.
   NOTA: Se recomienda un inserto de vidrio (consulte la Tabla de materiales) en lugar de tubos de plástico debido a los productos químicos reactivos al plástico utilizados durante el paso de derivatización posterior.
5. Someter las muestras secas a dos pasos consecutivos de derivatización para el análisis GC-MS de los metabolitos séricos.
   NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo una campana extractora debido a los riesgos de irritación de los solventes.
   1. Resuspender los extractos séricos secos en 30 μL de clorhidrato de metoxiamina 10 mg/mL (ver Tabla de Materiales) disueltos en piridina e incubar a 37 °C durante 30 min.
   2. Derivatizar muestras para la sililación de metabolitos con 70 μL de N-metil-N-terc-butildimetilsililrifluoroacetamida (MTBSTFA, ver Tabla de Materiales) a 70 °C durante 1 h.
      NOTA: Se recomienda usar una jeringa de vidrio en lugar de una punta de plástico en los siguientes pasos debido a los solventes de derivatización que reaccionan con el plástico.

4. Análisis metabolómico mediante GC-MS

NOTA: Se empleó GC-MS cuádruple simple (ver Tabla de materiales) para medir los diversos metabolitos séricos, incluidos los carbohidratos, los aminoácidos y los intermedios del ciclo del TCA en muestras derivatizadas de la vena de Sulzer y el ventrículo izquierdo. Alternativamente, se pueden utilizar otras columnas, aunque los ajustes experimentales, incluido el programa de temperatura, pueden variar en función de los tipos de columnas utilizados.

1. Inyectar 1 μL de la muestra derivatizada en el GC en modo splitless a 280 °C (temperatura de entrada), utilizando helio como gas portador con un caudal de 1.500 mL/min (consigna).
2. Ajuste el cuadrupolo a 200 °C con la interfaz GC-MS a 300 °C.
   NOTA: El programa de horno para todos los análisis de metabolitos comienza a 60 °C, se mantiene durante 1 minuto y luego se aumenta a una velocidad de 10 °C/min hasta que la temperatura alcanza los 320 °C.
3. Recoger datos por ionización de electrones (EI) fijada en 70 eV y adquirir los datos de la muestra en modo de barrido (50-550 m/z)⁵³. Todos los metabolitos utilizados en este estudio fueron previamente validados con estándares para confirmar espectros de masas y tiempos de retención.
4. Lleve a cabo la integración del área de picos utilizando un software de análisis disponible en el mercado (ver Tabla de materiales).
5. Haga coincidir los compuestos con el ion producto de cada derivado de TBMDS. A continuación, obtenga el cromatograma iónico de extracción (EIC) integrando el valor m/z del ion fragmento en el área de pico correspondiente y, a continuación, expórtelo. Los iones fragmentados se muestran en la Tabla 1.
   NOTA: El EIC de cada compuesto se normalizó por el de DL-norvalina en cada muestra. Los datos están representados por la vena de Sulzer Log₂ al ventrículo izquierdo (Log₂(SV/LV)) utilizando cada valor normalizado de EIC.

Resultados

La Figura 1 ilustra el esquema experimental de la metabolómica AV optimizada para BAT. Como se mencionó en la sección de Protocolo, para obtener tejidos adiposos marrones estimulados diferencialmente, los ratones se someten a aclimatación a la temperatura utilizando incubadoras de roedores o reciben administración farmacológica como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, los ratones son anestesiados y se recogen muestras de sangre para su análisis metabolómico (

Discusión

Un paso crítico para comprender el potencial metabólico de las MTD en el equilibrio energético de todo el cuerpo es definir qué nutrientes consume, cómo se procesan metabólicamente y qué metabolitos se liberan en la circulación. Este protocolo introduce una técnica especializada de muestreo arteriovenoso que permite el acceso a la vasculatura venosa de la MTD interescapular y a la vasculatura arterial sistémica en ratones C57BL/6J, que fue desarrollada y validada recientemente por Park et al^42...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-20 µL Filter Tips	Axygen	AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"	BD Biosciences	309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)	Agilent	G7077B
Agilent 7693A Autosampler	Agilent	G4513A
Agilent 8890 GC System	Agilent	G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI	Agilent	19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)	Agilent	G3335-90240
C57BL/6J mouse	DBL	C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)	LABCONCO	7811041
DL-Norvaline	Sigma-Aldrich	N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	30120086
Glass insert 250 μL	Agilent	5181-1270
Methanol (LC-MS grade)	Sigma-Aldrich	Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base	Sarstedt	20.1290.100
MTBSTFA	Sigma-Aldrich	394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)	Sigma-Aldrich	270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators	LABCONCO	7310041
Rodent diet	SAFE	SAFE R+40-10
Rodent incubator	Power scientific	RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"	BD Biosciences	328203
Vial Cap 9 mm	Agilent	5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL	Agilent	5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40	Axygen	PCR-02-C