تحديد مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم في متلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد

Summary

هنا يتم تقديم بروتوكول مفصل لعزل وتوصيف مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم من نماذج الفئران لمتلازمات خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد. تحدد هذه التقنية التغيرات في مكانة نخاع العظم غير المكونة للدم ، بما في ذلك الخلايا اللحمية البطانية واللحمة المتوسطة ، مع تطور المرض.

Abstract

تتكون البيئة المكروية لنخاع العظم من مجموعات خلايا متميزة ، مثل الخلايا اللحمية المتوسطة ، والخلايا البطانية ، وخلايا النسب العظمي ، والخلايا الليفية ، والتي توفر الدعم للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). بالإضافة إلى دعم HSCs الطبيعية ، تلعب البيئة المكروية لنخاع العظم أيضا دورا في تطوير اضطرابات الخلايا الجذعية المكونة للدم ، مثل متلازمات خلل التنسج النقوي (MDS) وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML). تؤدي الطفرات المرتبطة ب MDS في HSCs إلى كتلة في التمايز وفشل نخاع العظم التدريجي ، خاصة عند كبار السن. يمكن أن تتطور متلازمات خلل التنسج النقي في كثير من الأحيان إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد المقاوم للعلاج، وهو مرض يتميز بالتراكم السريع للأرومات النخاعية غير الناضجة. من المعروف أن البيئة المكروية لنخاع العظم تتغير في المرضى الذين يعانون من هذه الأورام النخاعية. هنا ، يتم وصف بروتوكول شامل لعزل وتوصيف الخلايا البيئية الدقيقة لنخاع العظم من نماذج الفئران لمتلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد. يمكن أن يساعد عزل وتوصيف التغيرات في مجموعات نخاع العظم المتخصصة في تحديد دورها في بدء المرض وتطوره وقد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة تستهدف التغيرات المعززة للسرطان في مجموعات انسجة نخاع العظم.

Introduction

تتكون البيئة المكروية لنخاع العظم من خلايا مكونة للدم ، وخلايا انسجة غير مكونة للدم ، ومصفوفة خارج الخلية ^1,2. يمكن لهذه البيئة المكروية أن تعزز التجديد الذاتي للخلايا الجذعية المكونة للدم ، وتنظيم تمايز النسب ، وتوفير الدعم الهيكلي والميكانيكي للأنسجة العظمية^{1،2،3،4،5}. يشمل مكانة اللحمية خلايا النسب العظمي والخلايا الليفية والخلايا العصبية والخلايا البطانية⁶ ، بينما يتكون مكان المكونة للدم من السكان اللمفاويين والنخاعيين

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة جامعة روتشستر للثروة الحيوانية. تم تربية الفئران والحفاظ عليها في مرافق رعاية في جامعة روتشستر. لنمذجة متلازمات خلل التنسج النقي عالية الخطورة ، يتم استخدام نموذج الفئران NHD13 المتاح تجاريا¹⁹ . في هذا النموذج ، يتم تحليل الخلايا اللحمية لنخاع العظم في إناث الفئران NHD13 في عمر 8 أسابيع ، قبل ظهور المرض. دي نوفو يتم إنشاء AML كما هو موضح سابقا^6،11،20. يتم تمييز الجينات المسرطنة المستخدمة للحث على ابيضاض الدم النقوي الحاد ، مثل MLL-AF9 و NRas ، ب GFP أو YFP ، مما يسمح بتحليل مجموعات ....

النتائج

توضح هذه المقالة طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحليل مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم ، مثل الخلايا اللحمية البطانية والوسيطة ، من نماذج MDS و Leukemia murine (الشكل 1). يصور الشكل 2 استراتيجية البوابات للكشف عن المجموعات السكانية ذات الأهمية ، بدءا من اختيا.......

Discussion

تم استخدام نماذج سرطان الدم الفئران على نطاق واسع لتحديد الإشارات الجوهرية للخلايا والمتخصصة التي تعزز تطور سرطان الدم النخاعي العدواني^6،19،21. هنا ، يتم تقديم بروتوكول شامل قائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد التركيب الخلوي للبيئة الدقيق.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038