Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Résumé

Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

Résumé

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de populations cellulaires distinctes, telles que les cellules stromales mésenchymateuses, les cellules endothéliales, les cellules ostéolignées et les fibroblastes, qui soutiennent les cellules souches hématopoïétiques (CSH). En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse joue également un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques, tels que les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM). Les mutations associées aux SMD dans les CSH entraînent un blocage de la différenciation et une insuffisance progressive de la moelle osseuse, en particulier chez les personnes âgées. Le SMD peut souvent évoluer vers une LAM résistante au traitement, une maladie caractérisée par une accumulation rapide de blastes myéloïdes immatures. On sait que le microenvironnement de la moelle osseuse est altéré chez les patients atteints de ces néoplasmes myéloïdes. Ici, un protocole complet pour isoler et caractériser phénotypiquement les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse à partir de modèles murins de syndrome myélodysplasique et de leucémie myéloïde aiguë est décrit. L’isolement et la caractérisation des changements dans les populations de niche de la moelle osseuse peuvent aider à déterminer leur rôle dans l’initiation et la progression de la maladie et peuvent conduire à la mise au point de nouvelles thérapies ciblant les altérations favorisant le cancer dans les populations stromales de la moelle osseuse.

Introduction

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de cellules hématopoïétiques, de cellules stromales non hématopoïétiques et de la matrice extracellulaire ^1,2. Ce microenvironnement peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, réguler la différenciation des lignées et fournir un soutien structurel et mécanique au tissu osseux 1,2,3,4,5. La niche stromale comprend les cellules ostéolinéaires, les fibroblastes, les cellules nerveuses et les cellules endothéliales⁶, tandis que la niche hématopoïétique comprend les populations lymphoïdes et myéloïdes ^1,2,3. En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse peut également jouer un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques tels que le SMD et la LMA 7,8,9,10,11. Il a été démontré que les mutations dans les cellules ostéoliférantes favorisent le développement du SMD, de la LAM et d’autres néoplasmes myéloprolifératifs 10,12,13,14.

Les syndromes myélodysplasiques sont un groupe de troubles pré-leucémiques qui résultent de mutations dans les cellules souches hématopoïétiques. Le SMD est souvent associé à un blocage de la différenciation des CSH et à la production de cellules dysplasiques, ce qui peut souvent entraîner une insuffisance de la moelle osseuse. Le SMD est le néoplasme myéloïde le plus fréquemment diagnostiqué aux États-Unis et est associé à un taux de survie à 3 ans de 35 % à 45 %¹⁵. Le SMD est souvent associé à un risque élevé de transformation en leucémie myéloïde aiguë. Il peut s’agir d’une complication fatale, car la LMA dérivée du SMD est résistante à la plupart des thérapies et susceptible de rechuter. La LAM qui survient de novo en raison de translocations ou de mutations dans la tige hématopoïétique et les progéniteurs est également souvent résistante à la chimiothérapie standard^16,17. Étant donné que le SMD et la LMA sont principalement des maladies de personnes âgées, la majorité d’entre eux étant diagnostiqués avant l’âge de 60 ans, la plupart des patients ne sont pas admissibles à une greffe de moelle osseuse curative. Il y a donc un besoin important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. Étant donné que le microenvironnement de la moelle osseuse peut fournir un soutien aux cellules malignes¹⁴, la définition des changements dans la niche de la moelle osseuse avec la progression de la maladie peut conduire à l’identification de nouvelles thérapies visant à inhiber le remodelage de la niche tumorale. Il est donc important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. À cette fin, il est essentiel d’identifier et de caractériser les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse qui peuvent fournir un soutien aux cellules malignes.

Plusieurs modèles murins de LAM et de SMD ont été générés et peuvent être utilisés pour étudier les changements dans le microenvironnement de la moelle osseuse au cours de l’initiation et de la progression de la maladie 6,1,19,20,21,22^. Ici, les protocoles permettant d’identifier les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse à l’aide de modèles murins de LAM ^6,20 induite rétroviralement, ainsi que le modèle Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible dans le commerce de la transformation du SMD à haut risque en LAM¹⁹, sont décrits. Les souris transplantées avec des cellules de LAM de novo succombent à la maladie en 20 à 30 jours⁶. Les souris NHD13 développent des cytopénies et une dysplasie de la moelle osseuse vers 15 à 20 semaines, qui se transforme finalement en LAM, et près de 75 % des souris succombent à la maladie vers 32 semaines. Pour analyser les populations du microenvironnement de moelle osseuse modèle murin, les os sont prélevés, la moelle osseuse et les spicules osseux sont digérés par digestion enzymatique, puis les cellules sont enrichies pour les populations non hématopoïétiques CD45-/Ter119- par tri magnétique. Bien que des analyses similaires aient déjà été décrites 11,13,22,23,24,25, elles se concentrent souvent sur la moelle osseuse ou l’os et n’intègrent pas de cellules des deux sources dans leurs analyses. La caractérisation combinée de ces populations, en conjonction avec des analyses de l’expression génique, peut fournir une compréhension complète de la façon dont le microenvironnement hématopoïétique cellulaire fournit un soutien à l’initiation et à la progression de la maladie (Figure 1). Bien que le protocole décrit ci-dessous se concentre sur un modèle de LAM induite par rétroviralité et un modèle de SMD génétique, ces stratégies peuvent être facilement adaptées pour étudier les changements dans la niche de la moelle osseuse de n’importe quel modèle murin d’intérêt.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris ont été élevées et maintenues dans les installations de soins aux animaux de l’Université de Rochester. Pour modéliser les SMD à haut risque, on utilise le modèle¹⁹ de souris murines NHD13 disponible dans le commerce. Dans ce modèle, les cellules stromales de la moelle osseuse sont analysées chez les souris femelles NHD13 à l’âge de 8 semaines, avant l’apparition de la maladie. De novo La LAM est générée comme décrit précédemment ^6,11,20. Les oncogènes utilisés pour induire la LMA, tels que MLL-AF9 et NRas, sont marqués avec GFP ou YFP, ce qui permet d’analyser les populations de moelle osseuse non leucémiques GFP à l’aide de la cytométrie en flux. En bref, des souris femelles C57BL/6J âgées de 10 semaines sont transplantées avec des cellules murines GFP/YFP+ AML, et la moelle osseuse est prélevée 2 semaines après la greffe. Bien que les souris femelles soient utilisées dans cette étude à des fins de démonstration, ce protocole peut être effectué avec des souris mâles ou femelles. Elle peut également être réalisée à l’aide d’un fémur ou de tous les os longs.

1. Prélèvement de moelle osseuse

REMARQUE : Pour plus de détails sur le protocole de dissection animale, veuillez vous référer à Amend et ^al.26.

1. Nettoyez le mortier et le pilon avec de l’éthanol à 70 %, rincez-les avec un tampon FACS réfrigéré (tableau 1) et placez-les sur de la glace pour qu’ils refroidissent avant de commencer la récolte. Placez également le tampon MAC (tableau 1) sur le banc pour lui permettre d’atteindre la température ambiante.
2. Euthanasier l’animal en suivant les lignes directrices et les protocoles de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
3. Sur la paillasse, vaporisez abondamment la souris avec de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce que sa fourrure soit mouillée. À l’aide d’une pince et de ciseaux courbés, soulevez la peau de l’abdomen et faites deux incisions d’environ 0,5 mm de longueur des deux côtés de la souris, latéralement à partir de l’abdomen. Ensuite, faites une incision de 0,5 mm distale à partir de l’abdomen. Tirez vers le bas pour enlever la peau et la fourrure des pattes de la souris.
4. Placez les ciseaux perpendiculairement au bassin, appuyez tout en tirant sur le fémur avec une pince. La tête fémorale doit se détacher du bassin. Séparez le fémur et le tibia au niveau de l’articulation fémoro-patellaire. Placez les os dans le tampon FACS dans une plaque à 6 puits sur de la glace.
5. Retirez les tissus des os à l’aide d’un tissu de qualité laboratoire et placez les os nettoyés dans une nouvelle plaque à 6 puits avec un tampon FACS frais sur de la glace.
6. Placez tous les os dans le mortier avec 2 à 5 mL de tampon FACS afin que tous les os soient immergés dans le tampon (ajustez le volume du tampon en fonction du nombre d’os que vous traitez). Écrasez et broyez les os à l’aide du pilon dans un mouvement circulaire jusqu’à ce que le tissu de la moelle osseuse soit libéré.
7. À l’aide d’une seringue de 3 ml, homogénéiser la moelle osseuse en tirant vers le haut et en évacuant le liquide du mortier.
8. À l’aide d’une seringue de 3 ml, extraire le liquide du mortier et le filtrer à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 ml sur de la glace. Rincez les morceaux d’os/tissu du filtre dans le mortier avec le tampon FACS et revenez à l’étape 1.7 pour homogénéiser et filtrer une deuxième fois. Celle-ci constitue la fraction de moelle osseuse.
9. Rincez les morceaux d’os restants (spicules) dans le mortier avec le tampon FACS et rincez-les dans un tube de 15 ml à l’aide du tampon FACS pour assurer un rendement cellulaire maximal. Il s’agit de la fraction des spicules osseux.

2. Digestion de la moelle osseuse

1. Centrifuger la moelle osseuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Décanter et jeter le surnageant.
2. Remettre la moelle osseuse en suspension dans 2 mL du mélange de digestion de la moelle osseuse (tableau 1) et la transférer dans un tube de 15 mL. Incuber à 37 °C pendant 45 min sur un rotateur.
3. Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.
4. Pelleter le mélange à 400 x g pendant 7 min à 4 °C.
5. Remettre en suspension la pastille de moelle osseuse dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux). Incuber 4 min sur glace.
6. Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la lyse. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.
7. Pulvériser le mélange à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon FACS.

3. Digestion des spicules osseux

1. Faites vortex les spicules osseux de l’étape 1.9 et laissez-les se déposer. Décanter le surnageant et conserver l’os en bas.
2. Remettre les spicules osseux en suspension dans 1 mL du mélange de digestion des spicules osseux (tableau 1).
3. Placez les tubes sur un rotateur de tubes pendant 60 min à 37 °C.
4. Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans le tube de 50 mL contenant de la moelle osseuse lysée et digérée par les globules rouges.

4. Coloration

1. Mélangez délicatement les spicules osseux et la suspension de cellules de moelle osseuse.
2. Utiliser 10 μL de la suspension cellulaire pour compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant une coloration à base de bleu de trypan à 0,4 %, comme décrit dans les protocoles publiés²⁷. Collectez 50 000 cellules pour un contrôle non coloré de la suspension cellulaire.
3. Centrifuger les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
   REMARQUE : Les anticorps peuvent être titrés pour déterminer la dilution idéale. La sélection des anticorps (épitopes et fluorochromes) peut être personnalisée.
4. Pour la coloration avec des anticorps pour la déplétion magnétique, ajouter le bloc FC (1 μL par 25 x 10⁶ cellules), le CD45-APC (10 μL par 25 x 10⁶ cellules) et le Ter119-APC (4 μL par 25 x 10⁶ cellules) (voir le tableau des matériaux).
5. Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS, retirer 50 000 cellules (~50 μL) pour le contrôle coloré par APC, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
6. Pour la coloration de la suspension cellulaire avec des microbilles pour l’appauvrissement magnétique, ajouter des mIgG (8 μL par 25 x 10⁶ cellules) et des microbilles anti-APC (20 μL par 25 x 10⁶ cellules) (voir le tableau des matériaux).
7. Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS de 10 mL, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.

5. Épuisement de l’échantillon par tri magnétique

REMARQUE : Cette étape est effectuée à l’aide d’un séparateur magnétique manuel disponible dans le commerce conformément aux instructions du fabricant. Cette étape peut également être effectuée à l’aide d’un séparateur automatisé (voir Tableau des matériaux).

1. Préparez la colonne LD en la lavant avec 2 mL de tampon MACs (tableau 1). Jetez l’effluent et changez le tube de collecte.
2. Remettre en suspension jusqu’à 1 x 10^{8 cellules dans} un tampon MAC et les filtrer à travers un tube à essai de 5 ml avec un capuchon de crépine de cellules de 35 μm.
3. Placez la colonne LD sur le support du séparateur magnétique. Placez un tube à essai de 5 mL sous la colonne pour recueillir l’éluat.
4. Ajoutez la suspension de cellule à la colonne LD préparée. Laissez la fraction négative s’écouler dans le tube de collecte. Lavez la colonne deux fois avec 1 mL de tampon MACs, en recueillant l’éluat dans le même tube. Il s’agit de la fraction négative utilisée à l’étape 5.6 ci-dessous.
5. Retirez la colonne LD du support du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube à essai de 5 ml. À l’aide d’une pipette, verser 3 mL de tampon dans la colonne afin d’éliminer les cellules qui ont été marquées positivement, à l’aide du piston de colonne.
6. Centrifuger les fractions négative et positive à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Mettez-les en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
7. Compter 10 μL des fractions négatives et positives avec 0,4 % de bleu de trypan. Les volumes pour l’ostéo-analyse/coloration du panel endothélial ci-dessous seront basés sur ce nombre de cellules.
8. Utilisez 50 000 cellules vivantes de la fraction positive pour les contrôles de contrôle par cytométrie en flux.

6. Ostéo-analyse/coloration du panneau endothélial

REMARQUE : La compensation doit être effectuée conformément aux protocoles standard de cytométrie en flux, y compris tous les contrôles de coloration et de déclenchement appropriés.

1. Pour la coloration de la fraction négative CD45/Ter119 (1 μL de chaque anticorps pour 1 x 10⁶ cellules), ajouter CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE et CD140a-PE-Cy5 (voir le tableau des matériaux).
2. Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec 2 mL de tampon FACS, puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Ajouter 1 mL de tampon FACS et une dilution de 1 :1000 de PI pour la coloration vivante/morte, puis filtrer l’échantillon à travers un tube à essai de 5 mL avec un capuchon de crépine de 35 μm.
4. Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux multicolore.

Résultats

Cet article décrit une méthode basée sur la cytométrie en flux pour analyser les populations microenvironnementales de moelle osseuse, telles que les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, à partir de modèles murins de SMD et de leucémie (Figure 1). La figure 2 illustre la stratégie de déclenchement pour la détection des populations d’intérêt, en commençant par la sélection des cellules (P1) dans la fraction digérée et appauvri...

Discussion

Les modèles de leucémie murine ont été largement utilisés pour identifier les signaux intrinsèques et de niche cellulaires qui favorisent la progression agressive de la leucémie myéloïde ^6,19,21. Ici, un protocole complet basé sur la cytométrie en flux pour définir la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse dans des modèles murins de SMD et de LAM est présenté.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038