Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Résumé

Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

Résumé

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de populations cellulaires distinctes, telles que les cellules stromales mésenchymateuses, les cellules endothéliales, les cellules ostéolignées et les fibroblastes, qui soutiennent les cellules souches hématopoïétiques (CSH). En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse joue également un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques, tels que les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM). Les mutations associées aux SMD dans les CSH entraînent un blocage de la différenciation et une insuffisance progressive de la moelle osseuse, en particulier chez les personnes âgées. Le SMD peut souvent évoluer vers une LAM résistante au traitement, une maladie caractérisée par une accumulation rapide de blastes myéloïdes immatures. On sait que le microenvironnement de la moelle osseuse est altéré chez les patients atteints de ces néoplasmes myéloïdes. Ici, un protocole complet pour isoler et caractériser phénotypiquement les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse à partir de modèles murins de syndrome myélodysplasique et de leucémie myéloïde aiguë est décrit. L’isolement et la caractérisation des changements dans les populations de niche de la moelle osseuse peuvent aider à déterminer leur rôle dans l’initiation et la progression de la maladie et peuvent conduire à la mise au point de nouvelles thérapies ciblant les altérations favorisant le cancer dans les populations stromales de la moelle osseuse.

Introduction

Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de cellules hématopoïétiques, de cellules stromales non hématopoïétiques et de la matrice extracellulaire ^1,2. Ce microenvironnement peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, réguler la différenciation des lignées et fournir un soutien structurel et mécanique au tissu osseux 1,2,3,4,5. La niche stromale comprend les cellules ostéolinéaires, les fibroblastes, ....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris ont été élevées et maintenues dans les installations de soins aux animaux de l’Université de Rochester. Pour modéliser les SMD à haut risque, on utilise le modèle¹⁹ de souris murines NHD13 disponible dans le commerce. Dans ce modèle, les cellules stromales de la moelle osseuse sont analysées chez les souris femelles NHD13 à l’âge de 8 semaines, avant l’apparition de la maladie. De novo La LAM est générée comme décrit précédemment

Discussion

Les modèles de leucémie murine ont été largement utilisés pour identifier les signaux intrinsèques et de niche cellulaires qui favorisent la progression agressive de la leucémie myéloïde ^6,19,21. Ici, un protocole complet basé sur la cytométrie en flux pour définir la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse dans des modèles murins de SMD et de LAM est présenté.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038