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요약

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

초록

골수 미세환경은 조혈모세포(HSC)를 지원하는 중간엽 기질 세포, 내피 세포, 골계통 세포 및 섬유아세포와 같은 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 조혈모세포 질환의 발병에도 중요한 역할을 합니다. HSC의 MDS 관련 돌연변이는 특히 노인에서 분화 및 진행성 골수 부전의 차단을 유발합니다. MDS는 종종 미성숙 골수성 모세포의 빠른 축적을 특징으로 하는 질병인 치료 저항성 AML로 진행될 수 있습니다. 골수 미세환경은 이러한 골수성 신생물 환자에서 변형되는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 세포를 분리하고 표현형적으로 특성화하기 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다. 골수 틈새 집단의 변화를 분리하고 특성화하면 질병 시작 및 진행에서 이들의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있으며 골수 기질 집단의 암 촉진 변화를 표적으로 하는 새로운 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다.

서문

골수 미세환경은 조혈 세포, 비조혈 기질 세포 및 세포외 기질 1,2로 구성됩니다. 이 미세환경은 조혈모세포의 자가재생을 촉진하고, 계통 분화를 조절하며, 뼈 조직 1,2,3,4,5에 구조적 및 기계적 지원을 제공할 수 있습니다. 기질 틈새는 골선세포, 섬유아세포, 신경세포, 내피세포6를 포함하며, 조혈 틈새는 림프구와 골수성 집단으로 구성된다 1,2,3. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 MDS 및 AML 7,8,9,10,11과 같은 조혈모세포 질환의 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 골혈통 세포의 돌연변이는 MDS, AML 및 기타 골수증식성 신생물의 발달을 촉진하는 것으로 나타났습니다 10,12,13,14.

골수이형성 증후군은 조혈모세포의 돌연변이로 인해 발생하는 백혈병 전단계 질환군입니다. MDS는 종종 HSC 분화 및 이형성 세포의 생성을 차단하는 것과 관련이 있으며, 이는 종종 골수 부전으로 이어질 수 있습니다. MDS는 미국에서 가장 흔하게 진단되는 골수성 신생물이며 3년 생존율은 35%-45%입니다15. MDS는 종종 급성 골수성 백혈병으로 전이될 위험이 높습니다. MDS에서 파생된 AML은 대부분의 치료에 내성이 있고 재발할 가능성이 높기 때문에 이는 치명적인 합병증이 될 수 있습니다. 조혈 줄기 및 전구 세포의 전위 또는 돌연변이로 인해 발생하는 AML은 종종 표준 화학 요법에 내성이 있습니다16,17. MDS와 AML은 주로 노인의 질병이며 대다수가 60세 이상이기 때문에 대부분의 환자는 근치적 골수 이식을 받을 수 없습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 골수 미세환경은 악성 세포를 지원할 수 있기 때문에14, 질병 진행에 따른 골수 틈새의 변화를 정의하면 종양 틈새 리모델링을 억제하는 것을 목표로 하는 새로운 치료법을 식별할 수 있습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 이를 위해서는 악성 세포를 지원할 수 있는 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하고 특성화하는 것이 중요합니다.

AML 및 MDS의 여러 쥐 모델이 생성되었으며 질병 시작 및 진행 중 골수 미세환경의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 6,1,19,20,21,22. 여기서, 후비랄 유도 AML 6,20의 쥐 모델을 사용하여 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하기 위한 프로토콜과 AML 형질전환(19)의 고위험 MDS의 상업적으로 이용 가능한 Nup98-HoxD13(NHD13) 모델이 설명된다. de novo AML 세포를 이식한 마우스는 20-30일 내에 질병에 굴복한다6. NHD13 마우스는 15-20주 경에 혈구감소증과 골수 이형성증이 발생하여 결국 AML로 전환되며 마우스의 거의 75%가 32주경에 질병에 굴복합니다. 쥐 모델 골수 미세환경 집단을 분석하기 위해 뼈를 채취하고, 효소 소화를 사용하여 골수 및 뼈 스피큘을 소화한 다음, 자기 분류를 통해 CD45-/Ter119- 비조혈 집단에 대해 세포를 농축합니다. 유사한 분석이 이전에 기술되었지만11,13,22,23,24,25 골수 또는 뼈에 초점을 맞추고 두 출처의 세포를 분석에 통합하지 않습니다. 유전자 발현 분석과 함께 이러한 집단의 결합된 특성 분석은 세포 조혈 미세환경이 질병 시작 및 진행을 어떻게 지원하는지에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다(그림 1). 아래에 설명된 프로토콜은 후귀바이러스로 유도된 AML 모델 및 유전적 MDS 모델에 중점을 두고 있지만, 이러한 전략은 관심 있는 쥐 모델의 골수 틈새 시장을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 로체스터 대학교 동물 자원 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 로체스터 대학의 동물 보호 시설에서 사육되고 유지되었습니다. 고위험 MDS를 모델링하기 위해 상업적으로 이용 가능한 NHD13 뮤린 모델19가 사용됩니다. 이 모델에서는 질병 발병 전 생후 8주에 암컷 NHD13 마우스에서 골수 기질 세포를 분석합니다. De novo AML은 앞서 설명한대로 생성됩니다 6,11,20. MLL-AF9 및 NRas와 같이 AML을 유도하는 데 사용되는 종양 유전자는 GFP 또는 YFP로 태그되어 유세포 분석을 사용하여 비백혈병 GFP- 골수 집단을 분석할 수 있습니다. 간단히 말해서, 10주 된 암컷 C57BL/6J 마우스에 쥐 GFP/YFP+ AML 세포를 이식하고, 이식 후 2주 후에 골수를 채취합니다. 이 연구에서는 시연 목적으로 암컷 마우스를 사용하지만, 이 프로토콜은 수컷 또는 암컷 마우스로 수행할 수 있습니다. 또한 하나의 대퇴골 또는 모든 긴 뼈를 사용하여 수행할 수 있습니다.

1. 골수 채취

참고: 동물 해부 프로토콜에 대한 자세한 내용은 Amend et al.26을 참조하십시오.

  1. 70% 에탄올로 절구와 유봉을 세척하고 식힌 FACS 완충액(표 1)으로 헹구고 얼음 위에 올려 식힌 후 수확을 시작합니다. 또한 MAC 버퍼(표 1)를 벤치에 놓아 실온에 도달할 수 있도록 합니다.
  2. 기관 동물 관리 및 사용 지침 및 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
  3. 벤치 탑에서 털이 젖을 때까지 쥐에게 70% 에탄올을 철저히 뿌립니다. 집게와 구부러진 가위를 사용하여 복부의 피부를 들어 올리고 복부 측면의 마우스 양쪽에 약 0.5mm 길이의 두 개를 절개합니다. 다음으로 복부에서 원위부를 0.5mm 절개합니다. 아래로 당겨 쥐의 다리에서 피부와 털을 제거합니다.
  4. 골반에 수직으로 가위를 놓고 집게로 대퇴골을 당기면서 아래로 누릅니다. 대퇴골두는 골반에서 분리되어야 합니다. 대퇴골대퇴 관절에서 대퇴골과 경골을 분리합니다. 얼음 위의 6웰 플레이트에 있는 FACS 완충액의 뼈를 놓습니다.
  5. 실험실 등급 조직을 사용하여 뼈에서 조직을 제거하고 세척된 뼈를 얼음에 신선한 FACS 완충액이 있는 새 6웰 플레이트에 넣습니다.
  6. 모든 뼈가 완충액에 잠기도록 2-5mL의 FACS 완충액을 사용하여 모든 뼈를 모르타르에 넣습니다(처리 중인 뼈 수에 따라 완충액의 부피 조정). 골수 조직이 풀릴 때까지 유봉을 사용하여 뼈를 부수고 갈아서 원을 그리며 합니다.
  7. 3mL 주사기를 사용하여 모르타르에서 액체를 위로 끌어 올려 아래로 흘려보내 골수를 균질화합니다.
  8. 3mL 주사기를 사용하여 모르타르에서 액체를 끌어 올리고 70μm 셀 스트레이너를 통해 얼음 위의 50mL 튜브로 여과합니다. FACS 완충액을 사용하여 필터의 뼈/조직 덩어리를 모르타르로 다시 헹구고 1.7단계로 돌아가 균질화하고 두 번째로 변형합니다. 이것이 골수 분획을 구성합니다.
  9. 남은 뼈 조각(스피큘)을 FACS 완충액으로 다시 헹구고 FACS 완충액을 사용하여 15mL 튜브로 세척하여 세포 수율을 극대화합니다. 이것은 뼈 스피큘 분율입니다.

2. 골수의 소화

  1. 골수를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고 폐기합니다.
  2. 골수 분해 혼합물 2mL에 골수를 재현탁하고(표 1) 15mL 튜브로 옮깁니다. 37°C에서 45분 동안 회전근에서 배양합니다.
  3. 효소 분해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 혼합물을 70μm 셀 스트레이너를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다.
  4. 혼합물을 400 x g 에서 4 °C에서 7 분 동안 펠렛합니다.
  5. 골수 펠릿을 1mL의 RBC 용해 완충액에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 얼음 위에서 4분간 배양합니다.
  6. 용해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 혼합물을 70μm 셀 스트레이너를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다.
  7. 혼합물을 300 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 100μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.

3. 뼈 스피큘의 소화

  1. 1.9단계에서 뼈 스피큘을 소용돌이치게 하고 가라앉히도록 합니다. 상층액을 디캔팅하고 뼈를 바닥에 유지합니다.
  2. 뼈 미세관 소화 혼합물 1mL에 뼈 미침을 재현탁시킵니다(표 1).
  3. 튜브를 37°C에서 60분 동안 튜브 회전기에 놓습니다.
  4. 효소 분해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 70μm 세포 여과기를 통해 혼합물을 여과하여 적혈구 용해 및 소화된 골수가 들어 있는 50mL 튜브에 넣습니다.

4. 염색

  1. 뼈 스피큘과 골수 세포 현탁액을 부드럽게 섞습니다.
  2. 공개된 프로토콜27에 설명된 대로 0.4% Trypan blue 기반 염색을 사용하여 혈구분석기에서 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 살아있는 세포 수를 계산합니다. 세포 현탁액에서 염색되지 않은 대조군을 위해 50,000개의 세포를 수집합니다.
  3. 나머지 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 100μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.
    참고: 항체는 이상적인 희석을 결정하기 위해 적정할 수 있습니다. 항체 선택(에피토프 및 형광 색소)은 사용자 정의할 수 있습니다.
  4. 자기 공핍 항체로 염색하려면 FC Block(25 x 106 세포당 1μL), CD45-APC(25 x 106 세포당 10μL) 및 Ter119-APC(25 x 106 세포당 4μL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
  5. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. FACS 완충액으로 세척하고, APC 염색 대조군을 위해 50,000개 세포(~50μL)를 제거하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고, 100μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  6. 자기 공핍을 위해 마이크로비드로 세포 현탁액을 염색하려면 mIgG(25 x 106 개 세포당 8μL) 및 Anti-APC 마이크로비드(25 x 106 개 세포당 20μL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
  7. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 10mL FACS 완충액으로 세척하고 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.

5. 자석 분류에 의한 시료 고갈

알림: 이 단계는 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 수동 자기 분리기를 사용하여 수행됩니다. 이 단계는 자동 분리기를 사용하여 수행할 수도 있습니다( 재료 표 참조).

  1. LD 컬럼을 2mL의 MACs 완충액으로 세척하여 준비합니다(표 1). 폐수를 버리고 수집 튜브를 교체하십시오.
  2. MAC 완충액에 최대 1 x 108 세포를 재현탁시키고 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 시험관을 통해 여과합니다.
  3. LD 컬럼을 자기 분리기 스탠드에 놓습니다. 컬럼 아래에 5mL 시험관을 배치하여 용리액을 수집합니다.
  4. 준비된 LD 컬럼에 셀 현탁액을 추가합니다. 음의 분획이 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 1mL의 MAC 완충액으로 컬럼을 두 번 세척하고 동일한 튜브에 용출액을 수집합니다. 이것은 아래 5.6단계에서 사용된 음의 분수입니다.
  5. 자기 분리기 스탠드에서 LD 컬럼을 제거하고 새 5mL 시험관에 놓습니다. 피펫을 사용하여 3mL의 버퍼를 컬럼에 분주하여 컬럼 플런저를 사용하여 양성 라벨이 부착된 세포를 플러시합니다.
  6. 음극 및 양극 분획을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다.
  7. 0.4% Trypan blue로 음극 및 양성 분획의 10μL를 계산합니다. 아래의 골분석/내피 패널 염색을 위한 부피는 이 세포 수를 기반으로 합니다.
  8. 유세포 분석 게이팅 대조군을 위해 양성 분획의 50,000개의 살아있는 세포를 사용합니다.

6. 골분석/내피패널 염색

참고: 보정은 모든 적절한 염색 및 게이팅 제어를 포함한 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 수행해야 합니다.

  1. CD45/Ter119 음성 분획(1 x 106 세포당 각 항체의 1μL)을 염색하려면 CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE 및 CD140a-PE-Cy5를 추가합니다( 재료 표 참조).
  2. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 2mL의 FACS 완충액으로 세척한 다음 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 살아있는/죽은 염색을 위해 1mL의 FACS 완충액과 1:1000 희석액의 PI를 추가한 다음 35μm 셀 스트레이너 캡이 있는 5mL 시험관을 통해 샘플을 여과합니다.
  4. multi-color 유세포 분석기에서 세포를 분석합니다.

결과

이 기사에서는 MDS 및 백혈병 쥐 모델에서 내피 및 중간엽 기질 세포와 같은 골수 미세환경 집단을 분석하기 위한 유세포 분석 기반 방법을 설명합니다(그림 1). 그림 2 는 분해된 CD45/Ter119 고갈된 분획에서 세포(P1)를 선택하는 것부터 시작하여 전방 및 측면 산란 프로파일을 통해 관심 집단을 검출하기 위한 게이팅 전략을 보여줍니다. 백혈병 샘플에서 ?...

토론

쥐 백혈병 모델은 공격적인 골수성 백혈병 진행을 촉진하는 세포 고유 및 틈새 유도 신호를 식별하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다 6,19,21. 여기에서는 MDS 및 AML의 쥐 모델에서 골수 미세환경의 세포 조성을 정의하기 위한 포괄적인 유세포 분석 기반 프로토콜을 제시합니다.

실험 샘플에서 유세포 분석 ?...

공개

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 말

URMC 유세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 연구는 미국 혈액학회 학술상, 백혈병 연구 재단 상, NIH 보조금 R01DK133131 및 J.B.에 수여된 R01CA266617의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipette Tips Genesee Scientific 24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge TubesAVANTL211511-CS
10 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1760
1000 mL Vacuum Filtration FlaskNEST344021
15 mL Centrifuge TubeVWR10026-076
2 mL Aspirating PipetteNEST325011
200 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm styleFalcon352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm styleFalcon352235
50 mL Centrifuge TubeNEST602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation LidFalcon353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture BarrierVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410.5 mg/mL 
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)Invitrogen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J MiceJackson Laboratory 664
Carbon Dioxide Gas TankAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Collagenase Type ISTEMCELL7415
Corning Mini CentrifugeCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD4513
Dispase II, powderGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Fine scissors - sharpFine Science Tools14061-10
Foundation B Fetal Bovine SerumGeminiBio900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter KitsFisherScientific F167370G
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocytometerFisher02-671-10
Incubator BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety CabinetNuaireNU-425-400
LD ColumnsMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vortex MixerCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS MULTI STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) MiceJackson Laboratory 010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)Biolegend1041060.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)Biolegend1359200.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco1514012210,000 U/mL
Plastipak 3 mL SyringeBecton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in WaterThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separator Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series CentrifugeThermo Scientific 75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%Gibco15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen15575-038

참고문헌

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