골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

요약

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

초록

골수 미세환경은 조혈모세포(HSC)를 지원하는 중간엽 기질 세포, 내피 세포, 골계통 세포 및 섬유아세포와 같은 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 조혈모세포 질환의 발병에도 중요한 역할을 합니다. HSC의 MDS 관련 돌연변이는 특히 노인에서 분화 및 진행성 골수 부전의 차단을 유발합니다. MDS는 종종 미성숙 골수성 모세포의 빠른 축적을 특징으로 하는 질병인 치료 저항성 AML로 진행될 수 있습니다. 골수 미세환경은 이러한 골수성 신생물 환자에서 변형되는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 세포를 분리하고 표현형적으로 특성화하기 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다. 골수 틈새 집단의 변화를 분리하고 특성화하면 질병 시작 및 진행에서 이들의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있으며 골수 기질 집단의 암 촉진 변화를 표적으로 하는 새로운 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다.

서문

골수 미세환경은 조혈 세포, 비조혈 기질 세포 및 세포외 기질 ^1,2로 구성됩니다. 이 미세환경은 조혈모세포의 자가재생을 촉진하고, 계통 분화를 조절하며, 뼈 조직 1,2,3,4,5에 구조적 및 기계적 지원을 제공할 수 있습니다. 기질 틈새는 골선세포, 섬유아세포, 신경세포, 내피세포⁶를 포함하며, 조혈 틈새는 림프구와 골수성 집단으로 구성된다 ^1,2,3. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 MDS 및 AML ^7,8,9,10,11

프로토콜

모든 동물 실험은 로체스터 대학교 동물 자원 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 로체스터 대학의 동물 보호 시설에서 사육되고 유지되었습니다. 고위험 MDS를 모델링하기 위해 상업적으로 이용 가능한 NHD13 뮤린 모델¹⁹가 사용됩니다. 이 모델에서는 질병 발병 전 생후 8주에 암컷 NHD13 마우스에서 골수 기질 세포를 분석합니다. De novo AML은 앞서 설명한^{대로 생성됩니다 6,11,20}. MLL-AF9 및 NRas와 같이 AML을 유도하는 데 사용되는 종양 유전자는 GFP 또는 YFP로 태그되어 유세포 분석을 사용하여 비백혈병 GFP- 골수 집단을 분석할 수 있습니다. 간단히 말해서, 10주 된 암컷 C57BL/6J 마우스에 쥐 GFP/YFP+ AML 세포를 이식하고, 이식 후 2주 후에 골수를 채취합니다. 이 연구에서는 시연 목적으로 암컷 마우스를 사용하지만, 이 프로토콜은 수컷 또는 암컷 마우스로 수행할 수 있습니다. 또한 하나의 대퇴골 또는 모든 긴 뼈를 사용하여 수행할 수 있습니다.

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토론

쥐 백혈병 모델은 공격적인 골수성 백혈병 진행을 촉진하는 세포 고유 및 틈새 유도 신호를 식별하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다 ^6,19,21. 여기에서는 MDS 및 AML의 쥐 모델에서 골수 미세환경의 세포 조성을 정의하기 위한 포괄적인 유세포 분석 기반 프로토콜을 제시합니다.

실험 샘플에서 유세포 분석 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038