Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Abstract

Il microambiente del midollo osseo è costituito da popolazioni cellulari distinte, come le cellule stromali mesenchimali, le cellule endoteliali, le cellule osteolignaggio e i fibroblasti, che forniscono supporto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo svolge anche un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche, come le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni associate alle MDS nelle HSC portano a un blocco della differenziazione e a una progressiva insufficienza del midollo osseo, soprattutto negli anziani. Le MDS possono spesso progredire verso la LMA resistente alla terapia, una malattia caratterizzata da un rapido accumulo di blasti mieloidi immaturi. È noto che il microambiente del midollo osseo è alterato nei pazienti con queste neoplasie mieloidi. Qui viene descritto un protocollo completo per isolare e caratterizzare fenotipicamente le cellule microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindrome mielodisplastica e leucemia mieloide acuta. L'isolamento e la caratterizzazione dei cambiamenti nelle popolazioni di nicchia del midollo osseo può aiutare a determinare il loro ruolo nell'inizio e nella progressione della malattia e può portare allo sviluppo di nuove terapie mirate alle alterazioni che promuovono il cancro nelle popolazioni stromali del midollo osseo.

Introduzione

Il microambiente del midollo osseo è costituito da cellule ematopoietiche, cellule stromali non ematopoietiche e dalla matrice extracellulare ^1,2. Questo microambiente può promuovere l'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, regolare la differenziazione del lignaggio e fornire supporto strutturale e meccanico al tessuto osseo 1,2,3,4,5. La nicchia stromale comprende le cellule dell'osteolignaggio, i fibroblasti, le cellule nervose e le cellule endoteliali⁶, mentre la nicchia ematopoietica è costituita dalle popolazioni linfoidi e mieloidi ^1,2,3. Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo può anche svolgere un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche come MDS e LMA 7,8,9,10,11. È stato dimostrato che le mutazioni nelle cellule osteolignaggi promuovono lo sviluppo di MDS, LMA e altre neoplasie mieloproliferative 10,12,13,14.

Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie preleucemiche che derivano da mutazioni nelle cellule staminali ematopoietiche. La MDS è spesso associata a un blocco della differenziazione delle HSC e alla produzione di cellule displastiche, che spesso possono portare a insufficienza del midollo osseo. La MDS è la neoplasia mieloide più comunemente diagnosticata negli Stati Uniti ed è associata a un tasso di sopravvivenza a 3 anni del 35%-45%¹⁵. La MDS è spesso associata a un alto rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta. Questa può essere una complicanza fatale, poiché la LMA derivata da MDS è resistente alla maggior parte delle terapie e può recidiva. Anche la LMA che insorge de novo a causa di traslocazioni o mutazioni nel tronco ematopoietico e nei progenitori è spesso resistente alla chemioterapia standard^16,17. Poiché le MDS e la LMA sono principalmente malattie degli anziani, con la maggior parte diagnosticate oltre i 60 anni, la maggior parte dei pazienti non è idonea per i trapianti curativi di midollo osseo. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. Poiché il microambiente del midollo osseo può fornire supporto alle cellule maligne¹⁴, la definizione dei cambiamenti nella nicchia del midollo osseo con progressione della malattia può portare all'identificazione di nuove terapie volte a inibire il rimodellamento della nicchia tumorale. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. A tal fine, è fondamentale identificare e caratterizzare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo che possono fornire supporto alle cellule maligne.

Sono stati generati diversi modelli murini di LMA e MDS che possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nel microambiente del midollo osseo durante l'inizio e la progressione della malattia 6,1,19,20,21,22. Qui, vengono descritti i protocolli per identificare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo utilizzando modelli murini di LMA ^6,20 indotta da retrovirale, nonché il modello Nup98-HoxD13 (NHD13) disponibile in commercio di MDS ad alto rischio in trasformazione^{AML 19}. I topi trapiantati con cellule di LMA de novo soccombono alla malattia in 20-30 giorni⁶. I topi NHD13 sviluppano citopenie e displasia del midollo osseo intorno alle 15-20 settimane, che alla fine si trasformano in LMA, e quasi il 75% dei topi soccombe alla malattia intorno alle 32 settimane. Per analizzare le popolazioni del microambiente del midollo osseo modello murino, le ossa vengono prelevate, il midollo osseo e le spicole ossee vengono digeriti utilizzando la digestione enzimatica e le cellule vengono quindi arricchite per le popolazioni non ematopoietiche CD45-/Ter119- mediante ordinamento magnetico. Sebbene analisi simili siano state descritte in precedenza 11,13,22,23,24,25, spesso si concentrano sul midollo osseo o sull'osso e non incorporano cellule provenienti da entrambe le fonti nelle loro analisi. La caratterizzazione combinata di queste popolazioni, in combinazione con le analisi dell'espressione genica, può fornire una comprensione completa di come il microambiente ematopoietico cellulare fornisca supporto per l'inizio e la progressione della malattia (Figura 1). Mentre il protocollo descritto di seguito si concentra sul modello di LMA indotto retroviralmente e su un modello genetico di MDS, queste strategie possono essere facilmente adattate per studiare i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo di qualsiasi modello murino di interesse.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi sono stati allevati e mantenuti nelle strutture per la cura degli animali dell'Università di Rochester. Per modellare le MDS ad alto rischio, viene utilizzato il modello murino NHD13¹⁹ disponibile in commercio. In questo modello, le cellule stromali del midollo osseo vengono analizzate in topi femmina NHD13 a 8 settimane di età, prima dell'insorgenza della malattia. De novo L'AML viene generato come descritto in precedenza ^6,11,20. Gli oncogeni utilizzati per indurre la LMA, come MLL-AF9 e NRas, sono marcati con GFP o YFP, consentendo l'analisi delle popolazioni di midollo osseo GFP non leucemiche utilizzando la citometria a flusso. In breve, topi femmina C57BL/6J di 10 settimane vengono trapiantati con cellule AML murine GFP/YFP+ e il midollo osseo viene raccolto 2 settimane dopo il trapianto. Mentre i topi femmina sono utilizzati in questo studio a scopo dimostrativo, questo protocollo può essere condotto con topi maschi o femmine. Può anche essere eseguita utilizzando un femore o tutte le ossa lunghe.

1. Prelievo del midollo osseo

NOTA: Per i dettagli sul protocollo di dissezione degli animali, fare riferimento a Amend et ^al.26.

1. Pulire il mortaio e il pestello con etanolo al 70%, sciacquarli con tampone FACS refrigerato (Tabella 1) e metterli sul ghiaccio a raffreddare prima di iniziare la raccolta. Inoltre, posizionare il tampone MACs (Tabella 1) sul banco per consentirgli di raggiungere la temperatura ambiente.
2. Sopprimere l'animale seguendo le linee guida e i protocolli istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
3. Sul piano di lavoro, spruzzare accuratamente il topo con etanolo al 70% fino a quando il pelo non è bagnato. Usando una pinza e delle forbici ricurve, sollevare la pelle sull'addome e praticare due incisioni di circa 0,5 mm di lunghezza su entrambi i lati del topo, lateralmente dall'addome. Successivamente, praticare un'incisione di 0,5 mm distale dall'addome. Tirare verso il basso per rimuovere la pelle e il pelo dalle zampe del topo.
4. Posizionare le forbici perpendicolarmente al bacino, premere verso il basso mentre si tira verso l'alto il femore con una pinza. La testa del femore dovrebbe staccarsi dal bacino. Separare il femore e la tibia all'articolazione femoro-rotulea. Posizionare le ossa nel tampone FACS in una piastra a 6 pozzetti su ghiaccio.
5. Rimuovere il tessuto dalle ossa utilizzando tessuto di laboratorio e posizionare le ossa pulite in una nuova piastra a 6 pozzetti con tampone FACS fresco su ghiaccio.
6. Mettere tutte le ossa nel mortaio con 2-5 ml di tampone FACS in modo che tutte le ossa siano immerse nel tampone (regolare il volume del tampone in base al numero di ossa che si stanno lavorando). Schiacciare e macinare le ossa usando il pestello con un movimento circolare fino a quando il tessuto del midollo osseo non viene rilasciato.
7. Utilizzando una siringa da 3 ml, omogeneizzare il midollo osseo tirando verso l'alto e sciacquando il liquido dal mortaio.
8. Utilizzando una siringa da 3 ml, estrarre il liquido dalla malta e filtrarlo attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL su ghiaccio. Sciacquare i pezzi di osso/tessuto dal filtro nel mortaio con tampone FACS e tornare al passaggio 1.7 per omogeneizzare e filtrare una seconda volta. Questa costituisce la frazione del midollo osseo.
9. Sciacquare i restanti pezzi di osso (spicole) nella malta con tampone FACS e sciacquarli in una provetta da 15 mL utilizzando un tampone FACS per garantire la massima resa cellulare. Questa è la frazione delle spicole ossee.

2. Digestione del midollo osseo

1. Centrifugare il midollo osseo a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Decantare e scartare il surnatante.
2. Risospendere il midollo osseo in 2 mL della miscela per la digestione del midollo osseo (Tabella 1) e trasferirlo in una provetta da 15 mL. Incubare a 37 °C per 45 minuti su un rotatore.
3. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.
4. Pellet la miscela a 400 x g per 7 minuti a 4 °C.
5. Risospendere il pellet di midollo osseo in 1 mL di tampone di lisi per globuli rossi (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 4 minuti con ghiaccio.
6. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la lisi. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.
7. Pellet la miscela a 300 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di tampone FACS.

3. Digestione delle spicole ossee

1. Vorticare le spicole ossee dal passaggio 1.9 e lasciarle depositare. Decantare il surnatante e trattenere l'osso sul fondo.
2. Risospendere le spicole ossee in 1 mL della miscela per la digestione delle spicole ossee (Tabella 1).
3. Posizionare i tubi su un rotatore di tubi per 60 minuti a 37 °C.
4. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm nella provetta da 50 mL contenente il midollo osseo lisizzato e digerito dai globuli rossi.

4. Colorazione

1. Mescolare delicatamente le spicole ossee e la sospensione delle cellule del midollo osseo.
2. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare per contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando la colorazione a base di blu di tripano allo 0,4%, come descritto nei protocolli pubblicati²⁷. Raccogli 50.000 cellule per un controllo non colorato dalla sospensione cellulare.
3. Centrifugare le restanti cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospenderlo in 100 μL di tampone FACS.
   NOTA: Gli anticorpi possono essere titolati per determinare la diluizione ideale. La selezione degli anticorpi (epitopi e fluorocromi) può essere personalizzata.
4. Per la colorazione con anticorpi per la deplezione magnetica, aggiungere FC Block (1 μL per 25 x 10⁶ cellule), CD45-APC (10 μL per 25 x 10⁶ cellule) e Ter119-APC (4 μL per 25 x 10⁶ cellule) (vedi Tabella dei materiali).
5. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS, rimuovere 50.000 cellule (~50 μL) per il controllo colorato con APC, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 100 μL di tampone FACS.
6. Per la colorazione della sospensione cellulare con microsfere per la deplezione magnetica, aggiungere mIgG (8 μL per 25 x 10⁶ cellule) e microsfere Anti-APC (20 μL per 25 x 10⁶ cellule) (vedere Tabella dei materiali).
7. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS da 10 mL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.

5. Esaurimento del campione mediante cernita magnetica

NOTA: Questa fase viene eseguita utilizzando un separatore magnetico manuale disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Questo passaggio può essere eseguito anche con un separatore automatizzato (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparare la colonna LD lavandola con 2 mL di tampone MACs (Tabella 1). Scartare l'effluente e sostituire la provetta di raccolta.
2. Risospendere fino a 1 x 10⁸ cellule nel tampone MAC e filtrarle attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro da 35 μm.
3. Posizionare la colonna LD sul supporto del separatore magnetico. Posizionare una provetta da 5 mL sotto la colonna per raccogliere l'eluato.
4. Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna LD preparata. Lasciare che la frazione negativa fluisca nella provetta di raccolta. Lavare la colonna due volte con 1 mL di tampone MACs, raccogliendo l'eluato nella stessa provetta. Questa è la frazione negativa utilizzata nel passaggio 5.6 di seguito.
5. Rimuovere la colonna LD dal supporto del separatore magnetico e posizionarla su una nuova provetta da 5 mL. Utilizzare una pipetta per erogare 3 mL di tampone nella colonna per eliminare le cellule che sono state marcate positivamente, utilizzando lo stantuffo della colonna.
6. Centrifugare le frazioni negativa e positiva a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospenderli in 100 μL di tampone FACS.
7. Contare 10 μL delle frazioni negativa e positiva con lo 0,4% di blu di tripano. I volumi per l'osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale di seguito si baseranno su questa conta cellulare.
8. Utilizzare 50.000 cellule vive dalla frazione positiva per i controlli di gating della citometria a flusso.

6. Osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale

NOTA: La compensazione deve essere eseguita seguendo i protocolli standard di citometria a flusso, compresi tutti i controlli appropriati di colorazione e gating.

1. Per la colorazione della frazione negativa CD45/Ter119 (1 μL di ciascun anticorpo per 1 x 10⁶ cellule), aggiungere CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (vedere la tabella dei materiali).
2. Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con 2 mL di tampone FACS, quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
3. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e una diluizione 1:1000 di PI per la colorazione viva/morta, quindi filtrare il campione attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro cellulare da 35 μm.
4. Analizza le cellule su un citometro a flusso multicolore.

Risultati

Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni microambientali del midollo osseo, come le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, da modelli murini di MDS e leucemia (Figura 1). La Figura 2 illustra la strategia di gating per l'individuazione delle popolazioni di interesse, a partire dalla selezione delle cellule (P1) nella frazione digerita e depleta di CD45/Ter119 attraverso il profilo di scatter dirett...

Discussione

I modelli di leucemia murina sono stati ampiamente utilizzati per identificare i segnali cellulari intrinseci e di nicchia che promuovono la progressione della leucemia mieloide aggressiva ^6,19,21. Qui, viene presentato un protocollo completo basato sulla citometria a flusso per definire la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo in modelli murini di MDS e AML.

Prima di acquisire i ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038