Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Abstract

Il microambiente del midollo osseo è costituito da popolazioni cellulari distinte, come le cellule stromali mesenchimali, le cellule endoteliali, le cellule osteolignaggio e i fibroblasti, che forniscono supporto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo svolge anche un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche, come le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni associate alle MDS nelle HSC portano a un blocco della differenziazione e a una progressiva insufficienza del midollo osseo, soprattutto negli anziani. Le MDS possono spesso progredire verso la LMA resistente alla terapia, una malattia caratterizzata da un rapido accumulo di blasti mieloidi immaturi. È noto che il microambiente del midollo osseo è alterato nei pazienti con queste neoplasie mieloidi. Qui viene descritto un protocollo completo per isolare e caratterizzare fenotipicamente le cellule microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindrome mielodisplastica e leucemia mieloide acuta. L'isolamento e la caratterizzazione dei cambiamenti nelle popolazioni di nicchia del midollo osseo può aiutare a determinare il loro ruolo nell'inizio e nella progressione della malattia e può portare allo sviluppo di nuove terapie mirate alle alterazioni che promuovono il cancro nelle popolazioni stromali del midollo osseo.

Introduzione

Il microambiente del midollo osseo è costituito da cellule ematopoietiche, cellule stromali non ematopoietiche e dalla matrice extracellulare ^1,2. Questo microambiente può promuovere l'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, regolare la differenziazione del lignaggio e fornire supporto strutturale e meccanico al tessuto osseo 1,2,3,4,5. La nicchia stromale comprende le cellule dell'osteolignaggio, i fibroblasti, le cellule nervose e....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi sono stati allevati e mantenuti nelle strutture per la cura degli animali dell'Università di Rochester. Per modellare le MDS ad alto rischio, viene utilizzato il modello murino NHD13¹⁹ disponibile in commercio. In questo modello, le cellule stromali del midollo osseo vengono analizzate in topi femmina NHD13 a 8 settimane di età, prima dell'insorgenza della malattia. De novo L'AML viene generato come descritto in precedenza

Discussione

I modelli di leucemia murina sono stati ampiamente utilizzati per identificare i segnali cellulari intrinseci e di nicchia che promuovono la progressione della leucemia mieloide aggressiva ^6,19,21. Qui, viene presentato un protocollo completo basato sulla citometria a flusso per definire la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo in modelli murini di MDS e AML.

Prima di acquisire i .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038