JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен подробный протокол выделения и характеристики микросредовых популяций костного мозга по мышиным моделям миелодиспластических синдромов и острого миелоидного лейкоза. Этот метод выявляет изменения в некроветворной нише костного мозга, включая эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, с прогрессированием заболевания.

Аннотация

Микроокружение костного мозга состоит из отдельных клеточных популяций, таких как мезенхимальные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки остеолинии и фибробласты, которые обеспечивают поддержку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Помимо поддержания нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также играет роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). МДС-ассоциированные мутации в ГСК приводят к блокированию дифференцировки и прогрессирующей недостаточности костного мозга, особенно у пожилых людей. МДС часто может прогрессировать до резистентного к терапии ОМЛ, заболевания, характеризующегося быстрым накоплением незрелых миелоидных бластов. Известно, что микроокружение костного мозга изменяется у пациентов с этими миелоидными новообразованиями. В данной работе описан комплексный протокол по выделению и фенотипической характеристике клеток микроокружения костного мозга из мышиных моделей миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза. Выделение и характеристика изменений в популяциях ниши костного мозга может помочь определить их роль в инициации и прогрессировании заболевания и может привести к разработке новых терапевтических средств, нацеленных на способствующие раку изменения в стромальных популяциях костного мозга.

Введение

Микроокружение костного мозга состоит из гемопоэтических клеток, негемопоэтических стромальных клеток и внеклеточного матрикса 1,2. Это микроокружение может способствовать самообновлению гемопоэтических стволовых клеток, регулировать дифференцировку линий и обеспечивать структурную и механическую поддержку костной ткани 1,2,3,4,5. Стромальная ниша включает костно-линейные клетки, фибробласты, нервные клетки и эндотелиальные клетки6, в то время как гемопоэтическая ниша состоит из лимфоидной и миелоидной популяций 1,2,3. В дополнение к поддержанию нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также может играть роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как МДС и ОМЛ 7,8,9,10,11. Было показано, что мутации в клетках остеолинии способствуют развитию МДС, ОМЛ и других миелопролиферативных новообразований 10,12,13,14.

Миелодиспластические синдромы представляют собой группу предлейкозных заболеваний, которые возникают в результате мутаций в гемопоэтических стволовых клетках. МДС часто ассоциируется с блокированием дифференцировки ГСК и выработкой диспластических клеток, что часто может привести к недостаточности костного мозга. МДС является наиболее часто диагностируемым миелоидным новообразованием в Соединенных Штатах и ассоциируется с 3-летней выживаемостью 35%-45%15. МДС часто ассоциируется с высоким риском трансформации в острый миелоидный лейкоз. Это может быть фатальным осложнением, так как ОМЛ, вызванный МДС, устойчив к большинству методов лечения и склонен к рецидиву. ОМЛ, возникающий de novo из-за транслокаций или мутаций в кроветворном стволе и предшественниках, также часто устойчив к стандартной химиотерапии16,17. Поскольку МДС и ОМЛ являются в первую очередь заболеваниями пожилых людей, большинство из которых диагностируются в возрасте старше 60 лет, большинство пациентов не имеют права на лечебную трансплантацию костного мозга. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. Поскольку микроокружение костного мозга может обеспечивать поддержку злокачественных клеток14, определение изменений в нише костного мозга с прогрессированием заболевания может привести к выявлению новых терапевтических средств, направленных на ингибирование ремоделирования опухолевых ниш. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. С этой целью крайне важно идентифицировать и охарактеризовать изменения в популяциях стромальных клеток костного мозга, которые могут обеспечить поддержку злокачественным клеткам.

Было создано несколько мышиных моделей ОМЛ и МДС, которые могут быть использованы для изучения изменений микроокружения костного мозга во время инициации и прогрессирования заболевания 6,1,19,20,21,22. Описаны протоколы выявления изменений в популяциях стромальных клеток костного мозга с использованием мышиных моделей ретровирусно индуцированного ОМЛ 6,20, а также коммерчески доступной модели трансформации МДС в ОМЛ высокого риска Nup98-HoxD13 (NHD13). Мыши, пересаженные клетками ОМЛ de novo, умирают от болезни через 20-30 дней6. У мышей NHD13 развиваются цитопения и дисплазия костного мозга примерно через 15-20 недель, которая в конечном итоге трансформируется в ОМЛ, и почти 75% мышей умирают от болезни примерно на 32 неделе. Для анализа популяций микроокружения костного мозга мышиной модели кости собирают кости, переваривают костный мозг и костные спикулы с помощью ферментативного расщепления, а затем клетки обогащают для CD45-/Ter119-негемопоэтических популяций с помощью магнитной сортировки. Несмотря на то, что подобные анализы были описаны ранее 11,13,22,23,24,25, они часто фокусируются либо на костном мозге, либо на костной ткани и не включают в свои анализы клетки из обоих источников. Комбинированная характеристика этих популяций в сочетании с анализом экспрессии генов может обеспечить всестороннее понимание того, как клеточное кроветворное микроокружение обеспечивает поддержку инициации и прогрессирования заболевания (рис. 1). В то время как протокол, описанный ниже, фокусируется на ретровирусно-индуцированной модели ОМЛ и генетической модели МДС, эти стратегии могут быть легко адаптированы для изучения изменений в нише костного мозга любой интересующей нас мышиной модели.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. Мыши были выведены и содержались в учреждениях по уходу за животными в Университете Рочестера. Для моделирования МДС высокого риска используется коммерчески доступная мышиная модельNHD13 19. В этой модели стромальные клетки костного мозга анализируются у самок мышей NHD13 в возрасте 8 недель, до начала заболевания. De novo AML генерируется, как описано ранее 6,11,20. Онкогены, используемые для индуцирования ОМЛ, такие как MLL-AF9 и NRas, помечены GFP или YFP, что позволяет анализировать нелейкозные популяции GFP-костного мозга с помощью проточной цитометрии. Вкратце, 10-недельным самкам мышей C57BL/6J трансплантируют мышиные клетки GFP/YFP+ AML, а костный мозг извлекают через 2 недели после трансплантации. В то время как самки мышей используются в этом исследовании в демонстрационных целях, этот протокол может быть проведен как с самцами, так и с самками мышей. Она также может быть проведена с использованием как одной бедренной кости, так и всех длинных костей.

1. Забор костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о протоколе вскрытия животных, пожалуйста, обратитесь к Amend et al.26.

  1. Очистите ступку и пестик 70% этанолом, промойте их охлажденным буфером FACS (Таблица 1) и положите на лед для охлаждения перед началом сбора урожая. Кроме того, поместите буфер MACs (Таблица 1) на стол, чтобы он нагрелся до комнатной температуры.
  2. Усыпляйте животное в соответствии с рекомендациями и протоколами по уходу за животными и их использованию.
  3. На столешнице тщательно опрыскайте мышь 70% этанолом, пока ее шерсть не станет влажной. С помощью щипцов и изогнутых ножниц поднимите кожу на животе и сделайте два надреза длиной примерно 0,5 мм с обеих сторон мыши, сбоку от живота. Далее делают разрез 0,5 мм дистальнее живота. Потяните вниз, чтобы удалить кожу и шерсть с лапок мыши.
  4. Расположите ножницы перпендикулярно тазу, надавите при этом щипцами на бедренную кость. Головка бедренной кости должна отделяться от таза. Отделите бедренную и большеберцовую кости в пателлофеморальном суставе. Поместите кости в буфер FACS в 6-луночную тарелку на льду.
  5. Удалите ткань из костей с помощью лабораторной ткани и поместите очищенные кости в новую 6-луночную пластину со свежим буфером FACS на льду.
  6. Поместите все кости в ступку с 2-5 мл буфера FACS так, чтобы все кости были погружены в буфер (отрегулируйте объем буфера в зависимости от того, сколько костей вы обрабатываете). Измельчите и измельчите косточки пестиком круговыми движениями до тех пор, пока ткань костного мозга не освободится.
  7. С помощью шприца объемом 3 мл гомогенизируйте костный мозг, вытягивая и смывая жидкость из раствора.
  8. С помощью шприца объемом 3 мл вытащите жидкость из раствора и профильтруйте ее через ситечко с ячейками 70 мкм в пробирку объемом 50 мл на льду. Промойте кусочки кости/ткани из фильтра обратно в раствор с буфером FACS и вернитесь к шагу 1.7 для гомогенизации и процеживания во второй раз. Это фракция костного мозга.
  9. Промойте оставшиеся костные кусочки (спикулы) обратно в раствор с буфером FACS и промойте их в пробирку объемом 15 мл с использованием буфера FACS, чтобы обеспечить максимальный выход клеток. Это фракция костных спикул.

2. Пищеварение костного мозга

  1. Центрифугируют костный мозг при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируйте костный мозг в 2 мл смеси для переваривания костного мозга (табл. 1) и переложите ее в пробирку объемом 15 мл. Инкубируют при 37 °C в течение 45 мин на вращателе.
  3. Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить ферментативное расщепление. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в новую пробирку объемом 50 мл.
  4. Гранулируйте смесь при 400 x g в течение 7 мин при 4 °C.
  5. Ресуспендант гранулы костного мозга в 1 мл лизисного буфера эритроцитов (см. таблицу материалов). Выдерживать 4 мин на льду.
  6. Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить лизис. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в новую пробирку объемом 50 мл.
  7. Гранулируйте смесь при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл буфера FACS.

3. Переваривание костных спикул

  1. Вкрутите костные спикулы, начиная с шага 1.9, и дайте им осесть. Сцедите надосадочную жидкость и сохраните кость на дне.
  2. Ресуспендировать костные спикулы в 1 мл смеси для переваривания костных спикул (табл. 1).
  3. Поместите пробирки на вращатель пробирок на 60 минут при температуре 37 °C.
  4. Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить ферментативное расщепление. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в пробирку объемом 50 мл, содержащую эритроциты, лизированные и переваренные костный мозг.

4. Окрашивание

  1. Аккуратно смешайте костные спикулы и суспензию клеток костного мозга.
  2. Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета количества живых клеток на гемоцитометре с использованием 0,4% окрашивания на основе трипанового синего, как описано в опубликованных протоколах27. Соберите 50 000 клеток для неокрашенного контроля из клеточной суспензии.
  3. Центрифугируют оставшиеся клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно поместите ее в 100 мкл буфера FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела могут быть титрованы для определения идеального разведения. Выбор антител (эпитопов и флуорохромов) можно настроить.
  4. Для окрашивания антителами для магнитного истощения добавляют FC Block (1 мкл на 25 x 106 клеток), CD45-APC (10 мкл на 25 x 106 клеток) и Ter119-APC (4 мкл на 25 x 106 клеток) (см. таблицу материалов).
  5. Инкубировать на льду 20 мин. Промыть буфером FACS, удалить 50 000 клеток (~50 мкл) для контроля окрашивания APC, центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C и ресуспендировать в 100 мкл буфера FACS.
  6. Для окрашивания клеточной суспензии микрогранулами для магнитного истощения добавляют микрогранулы mIgG (8 мкл на 25 x 106 клеток) и Anti-APC (20 мкл на 25 x 106 клеток) (см. таблицу материалов).
  7. Инкубировать на льду 20 мин. Промыть буфером FACS объемом 10 мл, центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.

5. Истощение образца магнитной сортировкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с помощью имеющегося в продаже ручного магнитного сепаратора в соответствии с инструкциями производителя. Этот шаг также может быть выполнен с помощью автоматического сепаратора (см. Таблицу материалов).

  1. Подготовьте колонку ЛД, промыв ее 2 мл буфера ПДК (табл. 1). Выбросьте стоки и замените сборную трубку.
  2. Ресуспендируйте до 1 x 10,8 ячеек в буфере MACs и отфильтруйте их через пробирку объемом 5 мл с крышкой сетчатого фильтра 35 мкм.
  3. Поместите колонну LD на подставку магнитного сепаратора. Поместите пробирку объемом 5 мл под колонку для сбора элюата.
  4. Добавьте клеточную суспензию в подготовленный столбик ЛД. Дайте отрицательной фракции протечь в сборную трубку. Промойте колонку дважды 1 мл буфера ПДК, собрав элюат в ту же пробирку. Это отрицательная дробь, используемая в шаге 5.6 ниже.
  5. Снимите колонку LD с подставки магнитного сепаратора и поместите ее в новую пробирку объемом 5 мл. С помощью пипетки дозируйте 3 мл буфера в колонку, чтобы вымыть клетки, которые были положительно помечены, с помощью поршня колонки.
  6. Центрифугируют отрицательную и положительную фракции при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте их в 100 мкл буфера FACS.
  7. Отсчитайте 10 мкл отрицательной и положительной фракций с 0,4% трипанового синего. Объемы для остеоанализа/окрашивания эндотелиальных панелей, приведенные ниже, будут основаны на этом количестве клеток.
  8. Используйте 50 000 живых клеток из положительной фракции для управления стробированием методом проточной цитометрии.

6. Остеоанализ/окрашивание эндотелиальной панели

ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация должна выполняться в соответствии со стандартными протоколами проточной цитометрии, включая все соответствующие средства контроля окрашивания и стробирования.

  1. Для окрашивания отрицательной фракции CD45/Ter119 (1 мкл каждого антитела на 1 x 106 клеток) добавляют CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE и CD140a-PE-Cy5 (см. таблицу материалов).
  2. Инкубировать на льду 20 мин. Промыть 2 мл буфера FACS, затем центрифугировать при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  3. Добавьте 1 мл буфера FACS и разбавление PI 1:1000 для окрашивания, затем отфильтруйте образец через пробирку объемом 5 мл с крышкой от сетчатого фильтра 35 мкм.
  4. Анализируйте клетки на многоцветном проточном цитометре.

Результаты

В данной статье описан метод анализа микросредовых популяций костного мозга, таких как эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, на основе проточной цитометрии на мышиных моделях МДС и лейкемии (рис. 1). На рисунке 2 показана стратегия стробиро...

Обсуждение

Модели мышиного лейкоза широко использовались для идентификации внутриклеточных и нишевых сигналов, способствующих прогрессированию агрессивного миелоидного лейкоза 6,19,21. Представлен комплексный протокол на основе проточной цитом...

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить URMC Flow Cytometry Core. Эта работа была поддержана премией Американского общества гематологов, премией Фонда исследования лейкемии и грантами NIH R01DK133131 и R01CA266617 присуждены J.B.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL pipette Tips Genesee Scientific 24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge TubesAVANTL211511-CS
10 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1760
1000 mL Vacuum Filtration FlaskNEST344021
15 mL Centrifuge TubeVWR10026-076
2 mL Aspirating PipetteNEST325011
200 µL pipette TipsGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological PipettesGlobe scientific1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm styleFalcon352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm styleFalcon352235
50 mL Centrifuge TubeNEST602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation LidFalcon353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture BarrierVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410.5 mg/mL 
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)Invitrogen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J MiceJackson Laboratory 664
Carbon Dioxide Gas TankAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Collagenase Type ISTEMCELL7415
Corning Mini CentrifugeCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD4513
Dispase II, powderGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Fine scissors - sharpFine Science Tools14061-10
Foundation B Fetal Bovine SerumGeminiBio900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter KitsFisherScientific F167370G
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocytometerFisher02-671-10
Incubator BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety CabinetNuaireNU-425-400
LD ColumnsMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Vortex MixerCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS MULTI STAND Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
MACsmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) MiceJackson Laboratory 010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)Biolegend1041060.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)Biolegend1359200.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco1514012210,000 U/mL
Plastipak 3 mL SyringeBecton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in WaterThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separator Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series CentrifugeThermo Scientific 75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%Gibco15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen15575-038

Ссылки

  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены