Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Zusammenfassung

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Zusammenfassung

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus verschiedenen Zellpopulationen, wie mesenchymalen Stromazellen, Endothelzellen, Osteostammzellen und Fibroblasten, die hämatopoetische Stammzellen (HSCs) unterstützen. Neben der Unterstützung normaler HSCs spielt die Mikroumgebung des Knochenmarks auch eine Rolle bei der Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellerkrankungen wie myelodysplastischen Syndromen (MDS) und akuter myeloischer Leukämie (AML). MDS-assoziierte Mutationen in HSCs führen zu einer Blockade der Differenzierung und zu einem fortschreitenden Knochenmarkversagen, insbesondere bei älteren Menschen. MDS kann oft zu einer therapieresistenten AML führen, einer Erkrankung, die durch eine schnelle Anhäufung unreifer myeloischer Blasten gekennzeichnet ist. Es ist bekannt, dass die Mikroumgebung des Knochenmarks bei Patienten mit diesen myeloischen Neoplasien verändert ist. In dieser Arbeit wird ein umfassendes Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung von Mikroumgebungszellen des Knochenmarks aus murinen Modellen des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie beschrieben. Die Isolierung und Charakterisierung von Veränderungen in den Nischenpopulationen des Knochenmarks kann dazu beitragen, ihre Rolle bei der Initiierung und dem Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen und kann zur Entwicklung neuartiger Therapeutika führen, die auf krebsfördernde Veränderungen in den Knochenmarkstromapopulationen abzielen.

Einleitung

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus hämatopoetischen Zellen, nicht-hämatopoetischen Stromazellen und der extrazellulären Matrix ^1,2. Diese Mikroumgebung kann die Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen fördern, die Differenzierung von Abstammungslinien regulieren und das Knochengewebe strukturell und mechanisch stützen 1,2,3,4,5. Die stromale Nische umfasst Osteolineage-Zellen, Fibroblasten, Nervenzellen und Endothelzellen

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom University of Rochester University Committee on Animal Resources genehmigt wurden. Mäuse wurden in den Tierpflegeeinrichtungen der University of Rochester gezüchtet und gepflegt. Zur Modellierung des Hochrisiko-MDS wird das kommerziell erhältliche NHD13-Mausmodell¹⁹ verwendet. In diesem Modell werden Knochenmarkstromazellen in weiblichen NHD13-Mäusen im Alter von 8 Wochen vor dem Ausbruch der Krankheit analysiert. De novo AML wird wie zuvor beschrieben ^6,11,20 er....

Diskussion

Maus-Leukämiemodelle wurden in großem Umfang verwendet, um zellintrinsische und nischengesteuerte Signale zu identifizieren, die das Fortschreiten der aggressiven myeloischen Leukämie fördern ^6,19,21. In dieser Arbeit wird ein umfassendes auf Durchflusszytometrie basierendes Protokoll zur Bestimmung der zellulären Zusammensetzung der Knochenmarkmikroumgebung in murinen Modellen von MDS und AML vorgestellt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038