Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Zusammenfassung

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Zusammenfassung

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus verschiedenen Zellpopulationen, wie mesenchymalen Stromazellen, Endothelzellen, Osteostammzellen und Fibroblasten, die hämatopoetische Stammzellen (HSCs) unterstützen. Neben der Unterstützung normaler HSCs spielt die Mikroumgebung des Knochenmarks auch eine Rolle bei der Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellerkrankungen wie myelodysplastischen Syndromen (MDS) und akuter myeloischer Leukämie (AML). MDS-assoziierte Mutationen in HSCs führen zu einer Blockade der Differenzierung und zu einem fortschreitenden Knochenmarkversagen, insbesondere bei älteren Menschen. MDS kann oft zu einer therapieresistenten AML führen, einer Erkrankung, die durch eine schnelle Anhäufung unreifer myeloischer Blasten gekennzeichnet ist. Es ist bekannt, dass die Mikroumgebung des Knochenmarks bei Patienten mit diesen myeloischen Neoplasien verändert ist. In dieser Arbeit wird ein umfassendes Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung von Mikroumgebungszellen des Knochenmarks aus murinen Modellen des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie beschrieben. Die Isolierung und Charakterisierung von Veränderungen in den Nischenpopulationen des Knochenmarks kann dazu beitragen, ihre Rolle bei der Initiierung und dem Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen und kann zur Entwicklung neuartiger Therapeutika führen, die auf krebsfördernde Veränderungen in den Knochenmarkstromapopulationen abzielen.

Einleitung

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus hämatopoetischen Zellen, nicht-hämatopoetischen Stromazellen und der extrazellulären Matrix ^1,2. Diese Mikroumgebung kann die Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen fördern, die Differenzierung von Abstammungslinien regulieren und das Knochengewebe strukturell und mechanisch stützen 1,2,3,4,5. Die stromale Nische umfasst Osteolineage-Zellen, Fibroblasten, Nervenzellen und Endothelzellen⁶, während die hämatopoetische Nische aus den lymphatischen und myeloischen Populationen besteht ^1,2,3. Neben der Unterstützung normaler HSCs kann die Mikroumgebung des Knochenmarks auch eine Rolle bei der Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellerkrankungen wie MDS und AML spielen 7,8,9,10,11. Es wurde gezeigt, dass Mutationen in Osteolinienzellen die Entwicklung von MDS, AML und anderen myeloproliferativen Neoplasien fördern 10,12,13,14.

Myelodysplastische Syndrome sind eine Gruppe präleukämischer Erkrankungen, die durch Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen entstehen. MDS ist häufig mit einer Blockade der HSZ-Differenzierung und der Produktion von dysplastischen Zellen verbunden, was häufig zu Knochenmarkversagen führen kann. MDS ist die am häufigsten diagnostizierte myeloische Neoplasie in den Vereinigten Staaten und mit einer 3-Jahres-Überlebensrate von 35 % bis 45 % ^verbunden15. MDS ist oft mit einem hohen Risiko für die Transformation in eine akute myeloische Leukämie verbunden. Dies kann eine tödliche Komplikation sein, da die MDS-abgeleitete AML gegen die meisten Therapien resistent ist und wahrscheinlich einen Rückfall erleidet. AML, die de novo aufgrund von Translokationen oder Mutationen im hämatopoetischen Stamm und in den Vorläuferzellen entsteht, ist häufig auch resistent gegen die Standard-Chemotherapie^16,17. Da es sich bei MDS und AML in erster Linie um Erkrankungen älterer Menschen handelt, wobei die meisten im Alter von über 60 Jahren diagnostiziert werden, kommen die meisten Patienten für eine kurative Knochenmarktransplantation nicht in Frage. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf, neue Regulatoren des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. Da die Mikroumgebung des Knochenmarks bösartige Zellen unterstützen kann¹⁴, kann die Definition von Veränderungen in der Knochenmarknische mit dem Fortschreiten der Krankheit zur Identifizierung neuer Therapeutika führen, die darauf abzielen, den Umbau von Tumornischen zu hemmen. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf, neue Regulatoren des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. Zu diesem Zweck ist es von entscheidender Bedeutung, Veränderungen in den Stromazellpopulationen des Knochenmarks zu identifizieren und zu charakterisieren, die die malignen Zellen unterstützen können.

Es wurden mehrere Mausmodelle für AML und MDS entwickelt, die zur Untersuchung von Veränderungen in der Mikroumgebung des Knochenmarks während des Krankheitsbeginns und -fortschreitens verwendet werden^können 6,1,19,20,21,22. Hier werden Protokolle zur Identifizierung von Veränderungen in den Knochenmark-Stromazellpopulationen unter Verwendung von murinen Modellen der retroviral induzierten AML ^6,20 sowie des kommerziell erhältlichen Nup98-HoxD13 (NHD13)-Modells der Hochrisiko-MDS-zu-AML-Transformation¹⁹ beschrieben. Mäuse, denen de novo AML-Zellen transplantiert wurden, erliegen der Krankheit innerhalb von 20-30 Tagen⁶. Die NHD13-Mäuse entwickeln in der 15. bis 20. Woche Zytopenien und Knochenmarkdysplasie, die sich schließlich in AML umwandeln, und fast 75 % der Mäuse erliegen der Krankheit nach etwa 32 Wochen. Um die mikroumgebungsspezifischen Populationen des murinen Modells des Knochenmarks zu analysieren, werden Knochen entnommen, Knochenmark und Knochenspikulen mittels enzymatischer Verdauung verdaut und die Zellen dann durch magnetische Sortierung für CD45-/Ter119-nicht-hämatopoetische Populationen angereichert. Obwohl ähnliche Analysen bereits beschrieben wurden 11,13,22,23,24,25, konzentrieren sie sich oft entweder auf das Knochenmark oder den Knochen und beziehen Zellen aus beiden Quellen nicht in ihre Analysen ein. Die kombinierte Charakterisierung dieser Populationen in Verbindung mit Genexpressionsanalysen kann ein umfassendes Verständnis dafür liefern, wie die zelluläre hämatopoetische Mikroumgebung die Initiierung und das Fortschreiten der Krankheit unterstützt (Abbildung 1). Während sich das unten beschriebene Protokoll auf ein retroviral induziertes AML-Modell und ein genetisches MDS-Modell konzentriert, können diese Strategien leicht angepasst werden, um Veränderungen in der Knochenmarknische jedes Mausmodells von Interesse zu untersuchen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom University of Rochester University Committee on Animal Resources genehmigt wurden. Mäuse wurden in den Tierpflegeeinrichtungen der University of Rochester gezüchtet und gepflegt. Zur Modellierung des Hochrisiko-MDS wird das kommerziell erhältliche NHD13-Mausmodell¹⁹ verwendet. In diesem Modell werden Knochenmarkstromazellen in weiblichen NHD13-Mäusen im Alter von 8 Wochen vor dem Ausbruch der Krankheit analysiert. De novo AML wird wie zuvor beschrieben ^6,11,20 erzeugt. Die Onkogene, die zur Induktion von AML verwendet werden, wie MLL-AF9 und NRas, sind mit GFP oder YFP markiert, was die Analyse der nicht-leukämischen GFP-Knochenmarkpopulationen mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Kurz gesagt, 10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse werden mit murinen GFP/YFP+ AML-Zellen transplantiert, und das Knochenmark wird 2 Wochen nach der Transplantation entnommen. Während in dieser Studie weibliche Mäuse zu Demonstrationszwecken verwendet werden, kann dieses Protokoll sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Mäusen durchgeführt werden. Sie kann auch entweder mit einem Oberschenkelknochen oder mit allen Röhrenknochen durchgeführt werden.

1. Entnahme des Knochenmarks

HINWEIS: Einzelheiten zum Präparationsprotokoll für Tiere finden Sie in Amend et ^al.26.

1. Reinigen Sie den Mörser und den Stößel mit 70%igem Ethanol, spülen Sie sie mit gekühltem FACS-Puffer ab (Tabelle 1) und legen Sie sie zum Abkühlen auf Eis, bevor Sie mit der Ernte beginnen. Platzieren Sie außerdem den MACs-Puffer (Tabelle 1) auf der Bank, damit er Raumtemperatur erreichen kann.
2. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den institutionellen Richtlinien und Protokollen für die Tierpflege und -verwendung.
3. Besprühen Sie die Maus auf dem Arbeitstisch gründlich mit 70%igem Ethanol, bis ihr Fell nass ist. Heben Sie mit einer Pinzette und einer gebogenen Schere die Haut am Bauch an und machen Sie zwei etwa 0,5 mm lange Schnitte auf beiden Seiten der Maus, seitlich vom Bauch. Als nächstes machen Sie einen 0,5 mm langen Schnitt distal vom Bauch. Ziehe nach unten, um die Haut und das Fell von den Beinen der Maus zu entfernen.
4. Setzen Sie die Schere senkrecht zum Becken auf, drücken Sie sie nach unten, während Sie den Oberschenkelknochen mit einer Pinzette nach oben ziehen. Der Hüftkopf sollte sich vom Becken lösen. Femur und Tibia am patellofemoralen Gelenk trennen. Legen Sie die Knochen in FACS-Puffer in eine 6-Well-Platte auf Eis.
5. Entfernen Sie Gewebe aus den Knochen mit Gewebe in Laborqualität und legen Sie die gereinigten Knochen in eine neue 6-Well-Platte mit frischem FACS-Puffer auf Eis.
6. Geben Sie alle Knochen mit 2-5 ml FACS-Puffer in den Mörser, so dass alle Knochen in den Puffer eingetaucht sind (passen Sie das Volumen des Puffers an, je nachdem, wie viele Knochen Sie verarbeiten). Zerkleinern und zerkleinern Sie die Knochen mit dem Stößel in kreisenden Bewegungen, bis das Knochenmarkgewebe freigesetzt wird.
7. Homogenisieren Sie das Knochenmark mit einer 3-ml-Spritze, indem Sie die Flüssigkeit aus dem Mörser herausziehen und herunterspülen.
8. Ziehen Sie die Flüssigkeit mit einer 3-ml-Spritze aus dem Mörser und filtern Sie sie durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Spülen Sie die Knochen-/Gewebestücke aus dem Filter mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel und kehren Sie zu Schritt 1.7 zurück, um sie ein zweites Mal zu homogenisieren und abzuseihen. Dies stellt die Knochenmarkfraktion dar.
9. Spülen Sie die verbleibenden Knochenstücke (Spikulen) mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel und spülen Sie sie mit FACS-Puffer in ein 15-ml-Röhrchen, um eine maximale Zellausbeute zu gewährleisten. Dies ist die Knochenspikulenfraktion.

2. Verdauung des Knochenmarks

1. Das Knochenmark wird bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Umfüllen und den Überstand verwerfen.
2. Das Knochenmark wird in 2 ml der Knochenmarkverdauungsmischung (Tabelle 1) resuspendiert und in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Bei 37 °C für 45 min auf einem Rotator inkubieren.
3. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Filtern Sie die Mischung durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.
4. Die Mischung wird bei 400 x g für 7 min bei 4 °C pelletiert.
5. Resuspendieren Sie das Knochenmarkpellet in 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Materialtabelle). 4 Minuten auf Eis inkubieren.
6. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die Lyse zu stoppen. Filtern Sie die Mischung durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.
7. Die Mischung wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl FACS-Puffer.

3. Verdauung von Knochenspikulen

1. Die Knochenspikulen aus Schritt 1.9 vortexen und absetzen lassen. Dekantieren Sie den Überstand und belassen Sie den Knochen an der Unterseite.
2. Resuspendieren Sie die Knochenspikulen in 1 ml der Knochenspikulationsaufschlussmischung (Tabelle 1).
3. Die Röhrchen für 60 min bei 37 °C auf einen Röhrchenrotator legen.
4. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Die Mischung wird durch ein 70-μm-Zellsieb in das 50-ml-Röhrchen mit Erythrozyten-lysiertem und verdautem Knochenmark filtriert.

4. Färbung

1. Die Knochenspikulen und die Knochenmarkzellsuspension vorsichtig mischen.
2. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung einer 0,4%igen Färbung auf Trypanblaubasis zu zählen, wie in den veröffentlichten Protokollen²⁷ beschrieben. Sammeln Sie 50.000 Zellen für eine ungefärbte Kontrolle aus der Zellsuspension.
3. Die restlichen Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in 100 μl FACS-Puffer.
   HINWEIS: Antikörper können titriert werden, um die ideale Verdünnung zu bestimmen. Die Auswahl der Antikörper (Epitope und Fluorochrome) kann individuell angepasst werden.
4. Für die Färbung mit Antikörpern gegen magnetische Depletion fügen Sie FC Block (1 μl pro 25 x 10⁶ Zellen), CD45-APC (10 μl pro 25 x 10⁶ Zellen) und Ter119-APC (4 μl pro 25 x 10⁶ Zellen) hinzu (siehe Materialtabelle).
5. 20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit FACS-Puffer waschen, 50.000 Zellen (~50 μl) für die APC-gefärbte Kontrolle entnehmen, 5 Minuten bei 4 °C bei 300 x g zentrifugieren und in 100 μl FACS-Puffer resuspendieren.
6. Für die Färbung der Zellsuspension mit Mikrokügelchen für die magnetische Depletion fügen Sie mIgG (8 μl pro 25 x 10⁶ Zellen) und Anti-APC-Mikrokügelchen (20 μl pro 25 x 10⁶ Zellen) hinzu (siehe Materialtabelle).
7. 20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit 10 ml FACS-Puffer waschen, bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.

5. Verarmung der Probe durch magnetische Sortierung

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen manuellen Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt kann auch mit einem automatischen Separator durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

1. Bereiten Sie die LD-Säule vor, indem Sie sie mit 2 ml MACs-Puffer waschen (Tabelle 1). Entsorgen Sie das Abwasser und wechseln Sie das Auffangröhrchen.
2. Resuspendieren Sie bis zu 1 x 10⁸ Zellen in MACs-Puffer und filtern Sie sie durch ein 5-ml-Reagenzglas mit einer 35-μm-Zellsiebkappe.
3. Stellen Sie die LD-Säule auf den Magnetabscheiderständer. Positionieren Sie ein 5-ml-Reagenzglas unter der Säule, um das Eluat aufzufangen.
4. Die Zellsuspension wird in die vorbereitete LD-Säule gegeben. Lassen Sie die negative Fraktion in das Sammelröhrchen durchfließen. Waschen Sie die Säule zweimal mit 1 ml MACs-Puffer und sammeln Sie das Eluat im selben Röhrchen. Dies ist der negative Bruch, der in Schritt 5.6 unten verwendet wird.
5. Nehmen Sie die LD-Säule vom Magnetabscheiderständer und stellen Sie sie auf ein neues 5-ml-Reagenzglas. Verwenden Sie eine Pipette, um 3 ml Puffer in die Säule zu geben, um positiv markierte Zellen mit dem Säulenkolben auszuspülen.
6. Die negativen und positiven Fraktionen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie sie in 100 μl FACS-Puffer.
7. Zählen Sie 10 μl der negativen und positiven Fraktionen mit 0,4 % Trypanblau. Die Volumina für die Osteo-Analyse/Endothel-Panel-Färbung unten basieren auf dieser Zellzahl.
8. Verwenden Sie 50.000 lebende Zellen aus der positiven Fraktion für Durchflusszytometrie-Gating-Kontrollen.

6. Osteo-Analyse/Endothel-Panel-Färbung

HINWEIS: Die Kompensation sollte nach Standard-Durchflusszytometrieprotokollen durchgeführt werden, einschließlich aller geeigneten Färbe- und Gating-Kontrollen.

1. Für die Färbung der CD45/Ter119-negativen Fraktion (1 μl jedes Antikörpers pro 1 x 10⁶ Zellen) fügen Sie CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE und CD140a-PE-Cy5 hinzu (siehe Materialtabelle).
2. 20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit 2 ml FACS-Puffer waschen, dann bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
3. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer und eine 1:1000-Verdünnung PI für die Lebend-/Totfärbung hinzu und filtrieren Sie die Probe dann durch ein 5-ml-Reagenzglas mit einer 35-μm-Zellsiebkappe.
4. Analysieren Sie die Zellen auf einem mehrfarbigen Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Dieser Artikel beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Analyse von Mikroumgebungspopulationen des Knochenmarks, wie z. B. der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, aus MDS- und Leukämie-Mausmodellen (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt die Gating-Strategie zur Detektion von Populationen von Interesse, beginnend mit der Selektion der Zellen (P1) in der verdauten und CD45/Ter119-abgereicherten Fraktion durch Vorwärts- und Seitenstreup...

Diskussion

Maus-Leukämiemodelle wurden in großem Umfang verwendet, um zellintrinsische und nischengesteuerte Signale zu identifizieren, die das Fortschreiten der aggressiven myeloischen Leukämie fördern ^6,19,21. In dieser Arbeit wird ein umfassendes auf Durchflusszytometrie basierendes Protokoll zur Bestimmung der zellulären Zusammensetzung der Knochenmarkmikroumgebung in murinen Modellen von MDS und AML vorgestellt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038