القياس الكمي للشوكميبة spp. الحركه

Summary

يصف هذا الإجراء كيفية تصور وتتبع وقياس Acanthamoeba spp. الحركه.

Abstract

التهاب القرنية الشوكميبي هو عدوى عينية حادة تشكل تحديات علاجية ويمكن أن تؤدي إلى العمى. على الرغم من انتشاره في كل مكان والتلوث المحتمل للعدسات اللاصقة بعد التعرض للماء ، فإن السلوك الطبيعي لهذا العامل الممرض لا يزال بعيد المنال. يمكن أن يخبرنا فهم أنماط حركة Acanthamoeba عن كيفية استعمار العدسات اللاصقة وتلويث قرنية المريض. من حسن الحظ أن أكانثاميبا النيابة. مرئية عبر مجهر برايت فيلد بدءا من تكبير 4x. تم تطوير تقنيات سابقة لتحديد حركة الشوكميبة فيما يتعلق بتأثيرات الاعتلال الخلوي أو التعرض الناقص للمجال الكهربائي. هنا ، نصف طريقة لتتبع وقياس Acanthamoeba spp. الحركة طويلة الأجل (من ساعات إلى أيام) ، وهو بروتوكول ينطبق على سلالات الأميبا المتعددة والأسطح والحالة التغذوية للأميبا. هذا الإجراء وثيق الصلة بتحديد العديد من الكميات الحركية الأساسية ، مثل المسافة والسرعة والحبس والاتجاه ، وهي ضرورية لمراقبة المراحل المختلفة للعدوى أو الانتشار أو التغيير السلوكي.

Introduction

زادت أبحاث الشوكميبة بشكل كبير في السنوات الأخيرة بسبب زيادة انتشار التهاب القرنية الشوكميبي (AK) ، وهو عدوى طفيلية بعد ارتباط الشوكميبة بالقرنية¹. في حين أن تفشي AK يمكن أن يعزى إلى العناية غير المناسبة بالعدسات اللاصقة أو حلول العناية بالعدسات اللاصقة غير الفعالة^2،3،4،5 ، لا توجد حاليا متطلبات لإثبات فعالية تطهير Acanthamoeba لأي منتج في السوق. ومع ذلك ، هناك جهد مستمر في المجتمع العلمي وداخل منظمات المعايير لفحص البروتوكولات اللازمة لتحديد فعالية تطهير منتجات العناية بالعدسات اللاصقة ^6,7. علاوة على ذلك ، نظرا لتشابهه في الجوانب الخلوية والوظيفية مع الضامة البشرية ، فقد لوحظ أن Acanthamoeba له دور مهم في استضافة ونشر مسببات الأمراض البشرية الأخرى⁸ ، بالإضافة إلى الإمراضية التي تجلبها الأميبا نفسها.

تم وصف التقنيات الحديثة التي كانت قادرة على تحديد حركة Acanthamoeba - والتي لا تخضع بشكل عام للحركة البراونية ^9,10 - فيما يتعلق بتأثيرات الاعتلال الخلوي أو التعرض الناقص للمجال الكهربائي ^9,11 ، بالإضافة إلى التقدم في تحليل الحركة في أبحاث الفيروسات العملاقة باستخدام Acanthamoeba كناقل فيروسي قابل للتتبع^{12 ، 13}. كانت هناك أيضا تحسينات مستمرة وكبيرة في تتبع الخلايا والجسيمات التي حدثت على مدار ال 20 عاما الماضية باستخدام برامج جديدة مثل برامج التصوير المستخدمة هنا ، والخوارزميات الجديدة وتقنيات التعلم العميق¹⁴. ومع ذلك ، يعد هذا مجالا علميا جديدا ومتناميا نسبيا فيما يتعلق بأبحاث الطاولة والتطبيق السريري والمعايير الصناعية ، وكان هناك ندرة في البيانات المنشورة فيما يتعلق بطرق تصور وتتبع هذه الأميبا ، لا سيما من أجل قياس التغيرات السلوكية بعد الالتزام بالعدسات اللاصقة أو أثناء أو بعد تطهير العدسات اللاصقة. وقد دعمت المجالات الأخرى التي تتوسع في المراقبة البصرية طويلة الأجل هذا الجهد^15،16،17. نظرا لطبيعة Acanthamoeba الصعبة بطبيعتها - بما في ذلك المقاومة العامة للبلازميدات (التي يمكن أن تمنح مضان) ، وقدرة الأميبا على استهلاك وتدمير أصباغ الخلايا القياسية ، وتركيب البروتين الخارجي الفريد - مما يجعل وضع علامات على الأجسام المضادة أمرا صعبا - كانت الطرق المتاحة للخلايا الأخرى التي تجعلها مرئية في أماكن أخرى غير تصوير برايت فيلد غير صالحة للاستعمال في هذا الكائن الحي. وبالتالي ، فإن تحديد حركة هذه الأميبا أظهر إضافة مهمة إلى هذا المجال. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، تمكنا من التأكد من أن الأميبا تظل متحركة لمدة 12 ساعة على الأقل بدون مغذيات¹⁸ وأن الأميبا التي يتم تحديها من خلال عملية التطهير وتتوقف عن الحركة أثناء التطهير يمكن أن تستعيد حركتها بعد التطهير إذا لم يتم تحليلها بالكامل¹⁹.

يوضح هذا البروتوكول كيفية تتبع حركة الأميبا وقياسها بصريا مجهريا. تتمثل الخطوات الأساسية في تسجيل الأميبا في برايت فيلد باستخدام التركيز والتوقيت المناسبين بين الصور ، وتحويل الصور إلى ثنائية باستخدام برنامج التصوير ، ثم استخدام المكون الإضافي لتتبع برنامج التصوير لتعيين المعلمات التجريبية ومتابعة كل أميبا لتحديد القياسات المطلوبة مثل السرعة والمسافة والحبس. بعد ذلك ، من الممكن تحديد الانجذاب الكيميائي للأميبا أو مجموعة الأميبا من أجل تحديد الاتجاه. تتمثل المساهمة الرئيسية لهذه الطريقة في تصور سلوك الأميبا وقياسه خلال حالات مختلفة من الدعم الغذائي ، أو الالتزام السطحي ، أو تحدي التطهير ، أو التغيرات البيئية الأخرى مثل التعايش مع زراعة خلايا الثدييات.

Protocol

1. إعداد الشوكميبة

ملاحظة: تم التحقق من هذا البروتوكول ل ATCC 50655 و 30872 و 50702 و 30010 و 30461 و 50370 و 50703 و 30137 و PRA-115 و PRA-411. هذا هو ممرض BSL2 ويجب أن يعمل داخل غطاء BSL2 والمختبر.

1. قم بإنشاء ثقافة رئيسية من قارورة عينة أو قابس²⁰ محضر عن طريق ملء قارورة T75 ب 30 مل من وسط AC6 وإضافة قابس واحد أو محتويات قارورة عينة إليها بشكل معقم. احتضان القارورة لمدة 3-5 أيام عند 26-30 درجة مئوية حتى تصبح القارورة متقاربة بنسبة 50٪ إلى 80٪.
2. مرور الخلايا في اليوم السابق للحاجة إليها لإنشاء مجموعة متجانسة من trophozoites.
   1. وفقا لاحتياجات السلالة ، هز و / أو ضرب بسرعة الثقافة الرئيسية 2x لإزاحة trophozoites الملتصقة.
   2. املأ قارورة T75 ب 30 مل من وسط AC6. أضف 2 مل من الثقافة الرئيسية إلى الممر. احتضان القارورة لمدة 18-24 ساعة عند 26-30 درجة مئوية.
3. قبل الحصاد ، افحص بصريا سكان التروفوزويت تحت تكبير 4x في المجهر. تأكد من أن التروفوزويتات ملتصقة وموحدة.
4. اضرب القارورة بسرعة 2x لإزاحة التروفوزيت الملتصقة. صب المحتويات في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
5. أدر الأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي متوازن لحبيبات الأميبا. صب أو ماصة قبالة الوسائط الطافية وتجاهل. تمييع بيليه في 2-10 مل من محلول رينغر.
6. دوامة العينة. أضف 10 ميكرولتر من العينة إلى مقياس الدم القابل للتصرف واحسب CFU / mL من Acanthamoeba.
7. بناء على عدد مقياس الدم ، قم بتخفيف حبيبات الأميبا إلى تركيز 7.5 × 10³ خلايا / مل في 1/4 محلول رينجر.
8. بذور الأميبا على السطح ، والتي يمكن أن تكون زجاجية أو بلاستيكية أو أجار غير مغذي ، ومجموعة متنوعة من أشكال الآبار حسب الاحتياجات التجريبية كما هو موضح أدناه.
   1. صفيحة 96 بئرا: قم بزرع كل بئر ب 200 ميكرولتر من معلق Acanthamoeba وأرفق اللوحة بالغطاء.
   2. صفيحة 48 بئرا: بذر كل بئر ب 1 مل من معلق الشوكميبة وأرفق اللوحة بالغطاء.
   3. خلية التدفق: أضف ببطء 4 مل من تعليق Acanthamoeba من خلال المنافذ المعقمة لخلية تدفق الألمنيوم المعقمة ، وتجنب الفقاعات في الغرفة. قم بإغلاق المنافذ بعد إضافة التعليق.
9. قبل التصوير ، اترك الأميبا لمدة 30 دقيقة على الأقل لتلتصق بالسطح قبل بدء التسجيل المجهري.

2. تصور وتسجيل الشوكميبة

1. تصور الأميبا عند تكبير 4x في برايتفيلد. يجب أن تظهر الخلفية باللون الرمادي الفاتح ، ويجب أن تكون الأميبا سوداء. اضبط الضوء والتركيز بحيث تكون الأميبا دوائر سوداء صلبة بدلا من شفافة (لذلك ، خارج التركيز قليلا ، الشكل 1.).
   ملاحظة: التكبير الأمثل هو 4x للتتبع لعدة أسباب: يجب عدم تضمين الأميبا التي تغادر أو تدخل مجال الرؤية أثناء التتبع في تحليل البيانات ، لذلك يدعم التكبير المنخفض بشكل أفضل الحد الأقصى لعدد الأميبا المضمنة في التحليل في فترة زمنية. يجب أن تظهر الأميبا كدوائر سوداء صلبة في برايت فيلد من أجل تحويلها إلى ثنائي لتحليل التتبع. من الأسهل تحقيق ذلك عند التكبير المنخفض ، حيث تكشف التكبيرات الأعلى بسهولة عن الطبيعة الشفافة والهياكل الداخلية للأميبا. بشكل عام ، يمكن التقاط المزيد من الأميبا في مجال رؤية واحد بتكبير أقل ، مما يدعم تحليل البيانات بشكل أكثر قوة.
2. اضبط برامج التسجيل في برنامج التصوير لتسجيل صورة على فترات منتظمة لتتبع الأميبا. أطول وقت بين الصور يسمح بالتتبع الدقيق هو 30 ثانية ، ويقترح الوقت الأمثل لحجم الملف وتفاصيل التتبع إما 12 ثانية أو 24 ثانية.
3. يمكن تتبع الأميبا لعدة أيام في كل مرة ، ولكن كن على دراية بحجم الملف الذي سيخلقه هذا النوع من التسجيل والصعوبة الكامنة في معالجة الملفات الكبيرة للغاية. لتجنب ذلك ، سجل الأميبا لأقسام من الوقت على فترات زمنية معينة. على سبيل المثال ، سجل لمدة 1 ساعة كل 12 ساعة لمدة 5 أيام.
4. إذا سمح المجهر والبرنامج ، فقم بتسجيل آبار متعددة في جلسة واحدة باستخدام إحداثيات XY لآبار الألواح أو مواقع متعددة لخلية التدفق. إذا لزم الأمر ، قم بتجميع أقسام متعددة من بئر واحد أو خلية تدفق لإنشاء مجال رؤية أكبر بتكبير 4x.
   ملاحظة: القيد الوحيد على عدد المواقع التي يمكن تسجيلها هو مدى سرعة انتقال مرحلة المجهر بين المواقع خلال فترة الفاصل الزمني للصورة (على سبيل المثال ، التقاط صورة كل 12 ثانية ، 24 ثانية ، إلخ). ومع ذلك ، هذا غير مطلوب ، ولا يزال من الممكن أن يحتوي تتبع مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها من موقع واحد على عدد كاف من المسارات لإجراء تحليل إحصائي قوي. تم استخدام مجهر نيكون Eclipse Ti-U في هذه الدراسة ، وتم استخدام المرحلة المتحركة الآلية لتسجيل الصور في آبار متعددة في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن أي مجهر مع إمكانية تسجيل قابلة للبرمجة سيعمل. يجب أن يتصل المجهر بجهاز كمبيوتر وأن يكون قادرا على تسجيل الصور على برنامج أو محرك أقراص ثابتة.

3. تحليل حجم الأميبا

1. افتح ملف المجهر في برنامج التصوير. سيتم فتح خيارات استيراد التنسيقات الحيوية. ضمن مربع الحوار ، تأكد من صحة ما يلي: عرض المكدس ؛ عرض مع: التحديد-هايبر ستاك; إدارة الذاكرة: حدد استخدام المكدس الظاهري ؛ وضع الألوان: افتراضي.
2. تأكد من عدم تنشيط أي من القوائم المنسدلة أو خانات الاختيار الأخرى. انقر فوق موافق.
3. افتح خيارات سلسلة التنسيقات الحيوية. اختر السلسلة المطلوبة. إذا تم تسجيل موقع واحد فقط في كل مرة ، فمن المحتمل أن يكون هناك خيار واحد فقط هنا. انقر فوق موافق.
4. اختر Image > Duplicate لتكرار البئر الفردي الذي يتم العمل به في كل مرة عن طريق اختيار قناة C واحدة فقط وقناة Z واحدة فقط.
5. من الآن فصاعدا ، اعمل فقط مع الصورة المكررة للتلاعب والتحليل ، وليس الأصل. اختر نوع > الصورة > 8 بت. اختر معالجة > طرح الخلفية.
6. اضبط الكرة المتدحرجة على 10.0. تحقق من الخلفية الفاتحة. تحقق انزلاق مكافئ.
7. اختر المعالجة > تحسين التباين. اضبط البيكسلات المشبعة على .1٪ للتروفوزويتات أو 0.3٪ لمجموعة من الخلايا والتجميعات.
8. اختر الصورة > ضبط عتبة > (الافتراضي > أبيض وأسود). جعل عملية ثنائية سيتم فتح. حدد افتراضي، وتحقق من الخلفية السوداء (للأقنعة الثنائية).
9. حدد العتبة بقوة بحيث تكون معظم نقاط الخلفية غير مرئية ، ولكن يكون جزء من كل أميبا مرئيا.
10. إذا كان برنامج التصوير قد عكس الصورة وكانت الخلفية بيضاء ، وكانت الأميبا سوداء ، فانتقل إلى تحرير > عكس لإصلاحها على خلفية سوداء وأميبا بيضاء.
11. اختر العملية> ثنائي > إغلاق ، في حالة وجود مساحة طفيفة في الخلايا في الغشاء الخارجي بسبب كونها خارج التركيز أو حركة الخلية.
12. اختر معالجة > ثنائي > ملء الثقوب. قم بإزالة العناصر غير الأميبا باستخدام أدوات رسم الأشكال وتحرير > التعبئة. إذا كانت الخلفية بيضاء عند هذه النقطة وكانت الأميبا سوداء ، فاختر تحرير > عكس. في هذه المرحلة ، يجب أن تمثل الصورة الصور الثنائية في الشكل 2.
13. لتسجيل حجم كل أميبا، اختر تحليل > تحليل الجسيمات. حجم المجموعة: 10-إنفينيتي ، دائرية: 0-1 ، عرض: لا شيء. تحقق فقط من عرض النتائج وتلخيصها.
14. احفظ ملفات CSV التي تظهر. اختر ملف > حفظ باسم > Tiff وقم بتحرير الاسم وفقا للمواصفات المطلوبة.

4. إعداد ملفات المجهر للتتبع (تحليل الحركة)

1. افتح ملف المجهر في برنامج التصوير. سيتم فتح خيارات استيراد التنسيقات الحيوية.
2. ضمن مربع الحوار ، تأكد من صحة ما يلي: عرض المكدس ؛ عرض مع: التحديد-هايبر ستاك. لإدارة الذاكرة، حدد استخدام المكدس الظاهري. انقر فوق موافق.
3. سيتم فتح خيارات سلسلة التنسيقات الحيوية. اختر السلسلة المطلوبة. إذا تم تسجيل موقع واحد فقط في كل مرة ، فمن المحتمل أن يكون هناك خيار واحد فقط هنا. انقر فوق موافق.
4. اختر صورة > تكرار. من الآن فصاعدا ، اعمل فقط على القسم المكرر من الفيديو بدلا من العمل على الملف الأصلي.
   ملاحظة: قم بتكرار قسم الفيديو الذي يتم تعقبه في ذلك الوقت. للقيام بذلك ، يحتاج المرء إلى معرفة الإطارات التي تتوافق مع الدقائق المطلوبة للتجربة. على سبيل المثال ، إذا أراد المرء^{تتبع الساعة الأولى} والتقاط الصور كل 24 ثانية ، فيجب أن يكون هناك 150 إطارا^{في الساعة الأولى} . لذلك ،^{ستكون الساعة الأولى} إطارات 1-150 ،^{وستكون الساعة الثانية} 151-300 ، وهكذا.
5. اختر > الصورة اكتب > 8 بت. اختر معالجة > طرح الخلفية. اضبط الكرة المتدحرجة على 10.0.
6. تحقق من الخلفية الفاتحة. تحقق انزلاق مكافئ. اختر معالجة > تحسين التباين واضبطه على 0.1٪.
7. تحقق من كل شرائح x # (على سبيل المثال ، جميع الشرائح ال 150). قم بإلغاء تحديد تطبيع. اختر Image > ضبط عتبة > (افتراضي > B&W).
8. جعل عملية ثنائية سيتم فتح. حدد افتراضي. تحقق من الخلفية السوداء (للأقنعة الثنائية).
9. عتبة بقوة ، لذلك معظم بقع الخلفية غير مرئية ، ولكن بعض أجزاء الأميبا مرئية. في هذه الخطوة، إذا كانت الخلفية بيضاء والأميبا سوداء، فاختر تحرير > عكس. يجب أن تكون الخلفية سوداء ، ويجب أن تكون الأميبا بيضاء.
10. اختر عملية > ثنائي > إغلاق. اختر معالجة > الثقوب الثنائية > التعبئة. اختر ملف > حفظ باسم > Tiff وقم بتحرير الاسم وفقا للمواصفات المطلوبة. الملف جاهز الآن للتعقب.

5. تحليل الحركة من خلال التتبع

1. من برنامج التصوير الذي يحتوي على ملف tiff المطلوب لتتبع الفتح ، انتقل إلى Plugins > Tracking > Trackmate. سيتم فتح إصدار Trackmate.
2. اختر التالي. حدد كاشف LoG من القائمة المنسدلة للكاشف. تعيين قطر النقطة المقدر: 35.0 ميكرون ، عتبة 1.0. قم بإلغاء تحديد استخدام عامل التصفية المتوسط والقيام بترجمة البكسل الفرعي.
3. انقر معاينة في الشرائح الأولى والوسطى والنهاية. تأكد من التقاط جميع الأميبا بواسطة دائرة أرجوانية وعدم تضمين عيوب الخلفية أو القطع الأثرية.
4. اختر التالي. ستبدأ المعالجة وقد تستغرق هذه الخطوة بضع دقائق. سيشير شريط الكشف في الجزء العلوي من الشاشة إلى مقدار اكتمال العملية.
5. اختر التالي عندما يطلب منك ذلك. في الحد الأدنى، اختر التالي مرة أخرى بدون تحديد أي شيء. حدد مشغل المكدس الفائق عند تحديد طريقة عرض. اختر التالي.
6. اضبط عامل التصفية على البقع واختر التالي دون تحديد أي شيء. حدد تعقب ؛ للقيام بذلك ، حدد LAP Tracker (بدلا من Simple LAP Tracker). اختر التالي.
7. عند الربط من إطار إلى إطار ، اضبط المسافة القصوى على 40 ميكرومتر. على المسار الصحيح ، تحقق من إغلاق فجوة المقطع السماح بإغلاق الفجوة. اضبط الحد الأقصى للمسافة لهذا عند 100 ميكرومتر والحد الأقصى لفجوة الإطار على 4. لا تحدد أي شيء لتقسيم مقطع المسار أو دمج مقطع المسار.
8. اختر التالي. قد يستغرق التتبع وقتا طويلا للتنفيذ. عند اكتماله ، يجب أن تقول النافذة: تم التتبع في x s في الأسفل. اختر التالي.
9. اختر التالي مرة أخرى عند اكتمال التعقب. تعيين الفلاتر على المسارات: حدد علامة + في أسفل اليسار لإضافة فلتر لعدد المواقع في المسارات. اضبط الفلتر على أعلى لما لا يقل عن 93٪ من الإطارات (على سبيل المثال ، سيحتاج 150 إطارا إلى 140 نقطة على الأقل).
   ملاحظة: ستتطلب بعض إصدارات هذا البرنامج تحديد المكافئ المعاكس ، مثل أقل من 7٪ على الأقل ، والذي يمكن القيام به عن طريق سحب خط إلى اليسار أو اليمين للوصول إلى الرقم المطلوب.
10. اختر التالي. ستظهر خيارات العرض. تأكد من أن المسارات في كل إطار ليست مشوهة أو غريبة في الطريقة التي تتحرك بها الأميبا قبل حفظ ملف Trackmate XML أو ملف Tracks CSV.
11. إذا كانت هناك حاجة إلى حذف مسار ، فانقر فوق TrackScheme. سيعرض TrackScheme جميع المسارات ونقاط الاتصال للأميبا عبر جميع الإطارات.
    ملاحظة: الأسباب المحتملة لحذف المسار هي أن الأميبا قد دخلت / خرجت من مجال الرؤية أثناء التسجيل ، أو تم تشكيل المسار بشكل غير مناسب مقارنة بالمسار الفعلي للأميبا ، أو لسبب ما ، فإن المسار أو الأميبا هو قيمة شاذة في البيانات وفقا للمعايير التجريبية ، إلخ.
12. انقر فوق الأميبا لتمييز البقعة الخضراء على الشاشة وفي Trackscheme سيكون للبقعة مربع أخضر يحيط بها. سيشير هذا إلى المسار أو المكان الذي يجب إزالته.
13. انقر بزر الماوس الأيمن على المسار الذي يجب إزالته وحدد المسار بالكامل. اضغط على الزر حذف .
14. بعد مراجعة جميع المسارات ، احفظ ملف التتبع بالنقر فوق حفظ في الجزء السفلي الأيسر من النافذة المنبثقة لبرنامج التتبع. احفظ ملف XML باستخدام اسم الفيديو. انقر فوق استئناف للعودة إلى النافذة المنبثقة لبرنامج التتبع.
15. انقر فوق المسارات وحدد المسارات على اليسار. انقر على تصدير إلى CSV واحفظ ملف CSV.
16. إذا لم يتعرف جدول البيانات على ملف CSV الناتج، فقم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. افتح ملف CSV المحفوظ في المفكرة. انقر فوق Control + A وControl + C لنسخ كافة المحتويات.
    2. افتح جدول البيانات وانقر على Control + V للصقه في جدول البيانات. ستكون جميع البيانات في خلية واحدة.
    3. مع استمرار تحديد الخلايا التي تحتوي على بيانات، انتقل إلى البيانات > نص إلى أعمدة. اختر محدد > التالي. اختر فاصلة > التالي > النهاية. احفظ هذا الملف باسم ملف CSV الجديد.
17. سيكون لتتبع CSV العديد من المعلمات المتاحة للتحليل (الشكل 3). انسخ والصق المعلمات المطلوبة في ملف CSV جديد (الشكل 4) لتحليلها. المعلمة المستخدمة هنا موصوفة أدناه.
    1. إجمالي المسافة المقطوعة: إجمالي المسافة التي تقطعها الأميبا بالميكرومتر.
    2. أقصى مسافة مقطوعة: أقصى مسافة على مسار الأميبا من نقطة البداية - قد لا تكون هذه بالضرورة نقطة النهاية
       
       حيث dij هي المسافة إلى أي بقعة I إلى أي بقعة j على المسار.
    3. نسبة الحبس: تشير نسبة الحبس إلى مدى كفاءة الأميبا في الابتعاد عن نقطة البداية: هل انتقلت في خط مستقيم بعيدا عن نقطة البداية (قيمة قريبة من 1) ، أم أنها بقيت قريبة نسبيا من نقطة البداية (قيمة قريبة من 0).
       
    4. متوسط سرعة المسار: متوسط سرعة الأميبا على إجمالي المسافة المقطوعة بالميكرون في الثانية.
       
    5. إزاحة المسار: المسافة بين نقطة بداية الأميبا ونقطة النهاية بالميكرونات.
       ملاحظة: يمكن العثور على جميع معلمات تحليل برامج التصوير وتعريفاتها هنا: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. تذكر أن كل ملف محفوظ هو ملخص للمسارات التي تم تحليلها في ذلك الوقت. لإنتاج تحليل قوي للبيانات ، سيحتاج المرء إلى الجمع بشكل مناسب بين النتائج من النسخ المتماثلة المتعددة ، والساعات ، وما إلى ذلك ، كما هو مناسب للبيانات (الشكل 5 والشكل 6).

النتائج

لتحقيق النجاح باستخدام هذه الطريقة ، هناك العديد من القطع الشاملة الحاسمة التي يجب مراعاتها. الأول هو الإعداد المادي للأميبا والمجهر ، والثاني هو الاستخدام السليم لبرنامج التصوير ، والثالث هو تصدير وتحليل بيانات التصوير بطريقة ذات معنى.

قبل بدء التسجيل المجهري ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الأميبا تركز بشكل صحيح على مرحلة المجهر (الشكل 1). بدلا من التركيز على الأميبا في المستوى Z الأمثل للحصول على التفاصيل الفردية ، من المثالي هنا عرضها خارج التركيز قليلا بحيث تصبح نقاطا سوداء صلبة بدلا من حالتها الشفافة عند عرضها بالتفصيل. سيسمح عرضها بهذه الطريقة لبرنامج التصوير وبرنامج التتبع بالعثور على كل أميبا فردية بسهولة أكبر عند تحويل الملف إلى ثنائي (الشكل 2). إن معرفة الهدف في برنامج التصوير - أي ظهور كل أميبا كدائرة بيضاء محددة جيدا ، قد يساعد القارئ في العثور على التركيز المناسب عند التقاط الصور الأصلية في برايتفيلد. بعد ذلك ، مع تحديد كل دائرة بوضوح ، سيكون برنامج التتبع قادرا على تتبع حركة وجمع مقاييس الحركة الفردية لكل أميبا بشكل صحيح.

بعد اتباع الإرشادات خطوة بخطوة في البروتوكول المذكور أعلاه لبرنامج التصوير وبرنامج التتبع والإشارة إلى الفيديو المرتبط للمساعدة في الخطوات الأولى الحاسمة لاستخدام برنامج التصوير ، فقد حان الوقت لتصدير بيانات برنامج التصوير للقياس الكمي وتحليل البيانات. سيكون الناتج الخام من برنامج التتبع مشابها لما هو موضح في الشكل 3. هنا ، من المهم التحقق من صحة عدد النقاط في المسارات التي تم تصديرها لما هو متوقع (على سبيل المثال ، إذا طلب المرء وجود 93٪ من الإطارات في كل مسار وكان لدى الآخر 100 إطار إجمالي في الفيديو ، فيجب أن يحتوي كل مسار تم تصديره على أكبر من أو يساوي 93 نقطة). إذا كانت البقع لا تتطابق مع المتطلبات ، فقد يحتاج المرء إلى الرجوع إلى خطوات برنامج التتبع لضمان تعيين المعلمات المطلوبة بشكل صحيح.

من التصدير الخام ، ابدأ في إنشاء ورقة تحليل البيانات (الشكل 4). من المهم أن تتذكر أن كل مسار يمثل أميبا مفردة داخل نسخة متماثلة مفردة. لذلك ، كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 ، يجب حساب متوسط جميع المسارات لمجموعة الإطارات أو النقطة الزمنية (الشكل 4) ، ويجب إجراء هذه العملية لكل مجموعة إطارات أو نقطة زمنية في سلسلة كاملة (على سبيل المثال ، إذا تم التقاط ما مجموعه 3 ساعات من الفيديو وتم تقسيم نقاط البيانات على الساعة ، ثم سيكون هناك ثلاث مجموعات إطارات / ساعات لتحليلها لكل نسخة متماثلة ، الشكل 5). أخيرا ، من هذه المجموعة من المتوسطات في كل مجموعة إطارات في كل نسخة متماثلة ، يجب دمج البيانات المتوسطة من كل نسخة متماثلة في مساحة واحدة بحيث يمكن تحليل البيانات عبر النسخ المتماثلة المتعددة لتحديد المتوسط الحقيقي والانحراف المعياري لكل نقطة زمنية (الشكل 6).

سيتم استخدام المتوسطات من كل نسخة متماثلة لتحليل البيانات ، وسيتم استخدام المتوسط المشترك والانحراف المعياري أو الخطأ المعياري من جميع النسخ المتماثلة للتمثيل الرسومي (كما هو موضح في مثال في الشكل 7). إذا كان تحليل البيانات كما فعلنا هنا ، وهو عينات متعددة يتم اتباعها خلال نقاط زمنية متعددة ، فمن الأنسب تحليلها باستخدام مقياس تكرار 2-way ANOVA مع اختبار Tukey اللاحق. وهذا يسمح لنا بتحديد الاختلافات بين العينات في كل نقطة زمنية، وكذلك تحديد الاختلافات داخل كل عينة بمرور الوقت.

الشكل 1: تظهر الأميبا كأشكال داكنة معتمة في مجهر برايتفيلد. تم تكبير الصورة التمثيلية للأميبا بتكبير 4x ، خارج التركيز قليلا لتظهر كدوائر داكنة صلبة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الأميبا المصورة في مجهر برايت فيلد تتحول إلى ثنائية وتتبع. تم تحويل الأميبا عند تكبير 4x ، في برايتفيلد (يسار) ، إلى ثنائي مع إزالة القطع الأثرية (في الوسط) ، وبعد التتبع ، مع ظهور مسارات محددة (يمين). الصف العلوي: صورة بئر كاملة عن طريق خياطة 4 صور معا ، شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. الصف السفلي: حجم صورة واحدة قبل الخياطة ، شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: يحتوي ناتج تحليل البيانات الفوري من برنامج التصوير والتتبع على مجموعة متنوعة من أنواع البيانات. يظهر الناتج التمثيلي من التتبع في الشكل 2 ، وهو فيديو مفرد. لاحظ أرقام المسار (السهم الأحمر) تخطي الأرقام ، مما يشير إلى أن برنامج التعقب أزال المسارات التي لم تتم محاذاتها مع المعلمات بشكل صحيح. في هذا المثال، تم تحديد 71 مسارا فقط من أصل 5385 مسارا متوافقا مع المعلمات. هذه النسبة طبيعية ، بالنظر إلى هذه الإرشادات الصارمة. يتماشى هذا العدد من المسارات أيضا مع عدد الأميبا المستخدمة في هذا البروتوكول (على سبيل المثال ، إذا تم زرع صفيحة 96 بئرا ب 200 ميكرولتر من 7.5 × 10³ CFU / mL لكل بئر ، فيجب على المرء أن يتوقع حوالي 1500 أميبا في البئر وتقريبا أن العديد منها مرئي في مجال رؤية مكون من 4 غرز. من المحتمل أن يكون هناك العديد من المسارات أكثر من الأميبا حيث تمشي الأميبا داخل وخارج مجال الرؤية ، مما يولد مسارات جديدة). يظهر رقم المسار هذا مرة أخرى في الشكل 2 ، حيث لا يظهر سوى عدد قليل من المسارات مقارنة بعدد كبير من المواقع. تحقق دائما من عدد النقاط في المسار (المربع الأحمر) للتأكد من تضمين أطوال المسار الصحيحة فقط. على سبيل المثال ، هنا ، نقوم بتضمين أكثر من 93٪ من الإطارات ، وكان هناك 127 إطارا في هذا القسم ، لذلك يجب أن تكون جميع أعداد النقاط أعلى من 118. تم تمييز القياسات التي تم ذكرها في البروتوكول باللون الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إعادة تنظيم البيانات حسب الحاجة بعد إخراج البيانات الأولي. تنظيم البيانات المطلوبة بعد التصدير. (أ) تم نسخ القياسات ذات الصلة المختارة للقياس الكمي من تصدير برنامج التتبع (الشكل 3) ولصقها في جدول بيانات جديد. (ب) بعد تنظيم القياسات المطلوبة في جدول البيانات الجديد ، يجب حساب متوسط كل مسار. وبالتالي ، في هذا المثال التمثيلي ، تم حساب متوسط المسافة الإجمالية والمسافة القصوى والحبس ومتوسط السرعة والإزاحة لكل مسار قابل للاستخدام في هذا الفيديو المفرد إلى رقم واحد لكل قياس. لاحظ مرة أخرى هنا أن ما مجموعه 71 مسارا استوفت معايير الإطارات 1-127. من المحتمل أن يكون هناك عدد مختلف من المسارات المناسبة من كل مقطع فيديو أو مجموعة إطارات تم تحليلها ، كما هو موضح في الشكل 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: إطارات متسلسلة تم تعيينها لتحليل سلسلة صور أو فيديو كامل. هذه صورة تمثيلية لإضافة مقاطع فيديو متسلسلة إلى تحليل البيانات. بافتراض أن الإطارات 1-127 تشكل الساعة 1 من الفيديو (هنا ، يتكون 1 h من التقاط صورة مرة كل 28 ثانية). ستكون الإطارات 128-254 هي الساعة 2 من الفيديو ، وستكون الإطارات 255-381 هي الساعة 3 من الفيديو. اجمع البيانات المصدرة (كما تم تصديرها في الشكل 3) من جميع الساعات في ورقة واحدة للعمل معها جميعا مرة واحدة. كما هو الحال في الشكل 4 ، سيتم حساب متوسط البيانات من جميع المسارات القابلة للاستخدام لكل مجموعة إطارات / ساعة. كل شيء في الشكل 5 هو البيانات من نسخة واحدة أو عينة واحدة. إذا كان هناك 3 نسخ متماثلة ، فسيكون هناك 3 علامات تبويب منفصلة لجداول البيانات موضوعة بشكل متطابق ، وسيتم إدخال البيانات منها في علامة تبويب جديدة ، كما هو موضح في الشكل 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: البيانات المركبة من جميع الأميبا في كل مجموعة إطارات تستخدم لتمثيل نسخة متماثلة واحدة. (أ) يجب جمع جميع المتوسطات من كل إطار محدد في الشكل 5 في موقع مركزي حتى يمكن إكمال تحليل البيانات النهائي. في هذه الصورة التمثيلية، يتم عرض متوسطات المسافة الإجمالية من مجموعات الإطارات الثلاثة الأولى (أو الساعات). يجب تكرار ذلك لكل عينة / حالة / نسخة متماثلة يتم تشغيلها. بعد ذلك ، يجب حساب متوسط المتوسطات من كل عينة من كل مجموعة إطارات (المربع الأصفر). هذه هي نقطة البيانات النهائية التي يمكن من خلالها حساب الانحراف المعياري والخطأ المعياري. المتوسطات الفردية من كل عينة (هنا ، الأرقام في B3 و B4 و B5 لعينة المسافة الإجمالية 1 ؛ C3 و C4 و C5 لعينة المسافة الإجمالية 2 ، إلخ.) لتشغيل التحليل الإحصائي. سيتم تكرار هذه العملية لجميع القياسات المطلوبة (المسافة القصوى ، الحبس ، متوسط السرعة ، الإزاحة ، إلخ.) (ب) لعمل تمثيل بياني للقياس الكمي، استخدم الأرقام الموجودة في المربع الأصفر كنقاط بيانات لاستخدامها في التمثيل البياني النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: بيانات الحركة الأولية ل ATCC 30461 و ATCC 50370. تم جمع البيانات الأولية (الممثلة هنا كمتوسط ± SE لكل ساعة) سابقا ولم يتم نشرها للدراسات السابقة^18,19. يوضح هذا القياس الكمي للحركة أن هاتين الأميبا متشابهتان في أول 6 ساعات من الحركة (كما تم قياسها بالمسافة الإجمالية بالميكرون المقطوع في تلك الساعة) في محلول رينغر على سطح زجاجي. تمثل كل نقطة زمنية ثلاث نسخ متماثلة منفصلة ، يتكون كل منها من 20-200 مسار أميبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

إن القدرة على تتبع وقياس حركة الأميبا مثل Acanthamoeba ، وهي كائنات مجهرية ملتصقة لا تتأثر بالحركة البراونية منخفضة السرعة ^9,10 ، تكشف عن قدر كبير من المعلومات حول سلوك الأميبا ويمكن أن تعزز بشكل كبير التنوير فيما يتعلق بطرق الوقاية من AK. تم تفصيل هذا البروتوكول في المنشورات الحديثة ، وتم تأكيد البيانات أو دمجها مع تحليلات بيانات أخرى^{مماثلة 18,19}. ونلاحظ هنا أن سرعة الأميبا المفصلة باستخدام هذه الطريقة تشبه ما تم نشره من قبل مجموعات أخرى. يتميز هذا البروتوكول بقدرته على استخدامه بشكل أساسي على أي علاج سطحي أو أميبا ، وهو شفاف للضوء ، ولكن من المهم ملاحظة أنه في حين يمكن تعديل هذا البروتوكول للعمل مع الكائنات الحية الأخرى ، فقد تم تحسينه فقط حتى الآن ل Acanthamoeba. لقد عمل البروتوكول أعلاه بشكل جيد باستمرار في المختبر ، ولكن يتم توفير التعديلات التالية لتغيير الطريقة لتناسب الاحتياجات الأخرى أو استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المواقف الصعبة.

تحديد معلمات التتبع: في البروتوكول أعلاه ، تم سرد الربط من إطار إلى إطار ، وإغلاق الفجوة ، وفجوة الإطار القصوى ، وعدد النقاط على المسار الصحيح ، والتي كانت الأكثر قابلية للتطبيق على المنشورات الحديثة. ومع ذلك ، من الممكن أن تكون المعلمات الأخرى أكثر ملاءمة للاحتياجات الأخرى. علاوة على ذلك ، قد تكون هناك معلمات يرغب الآخرون في استخدامها ولكن لم يتم استخدامها هنا (مثل المسافة القصوى للمسار ضمن مرشحات المسار). يمكن الوصول إلى مزيد من المعلومات حول كل معلمة وما تصفه هنا على موقع الويب (انظر المرجع²¹). عند تحديد المعلمات والمرشحات الأكثر صلة بالتجارب الأخرى وكيفية تعيينها ، فكر في ما هو منطقي إحصائيا لمشروع معين ؛ على سبيل المثال ، هل يريد المرء بيانات من الأميبا التي تنطلق ثم تعود إلى مجال الرؤية؟ أو هل يرغب المرء في الاحتفاظ بالبيانات من الأميبا التي لم تتحرك كثيرا على الإطلاق ولكن لا يزال يتم وضع علامة عليها كمسار؟ وما هو منطقي لعدد الإطارات وطول الفترة الزمنية بين الإطارات عند تسجيل الصور.

تغيير حجم النقطة: وجدنا أنه من الصعب للغاية مع أي برنامج أو أي إعداد مجهر - استنادا إلى التقنيات والبرامج الحالية المتاحة للمختبرات القياسية - تتبع عدد الأميبا بدقة في المجموع لأنها تتغير بمرور الوقت. إذا كنت تتبع حجم النقطة ومحاولة ربط هذا الحجم بعدد الكائنات الحية فيها ، فاستخدم منحنى قياسيا تم إنشاؤه بعد التجارب المتكررة للتنبؤ رياضيا بحجم الركام. على سبيل المثال ، تم إنشاء الركام عن طريق زرع الآبار بمجموعة من أعداد الأميبا ، مثل 8 و 16 و 32 و 125 و 250 و 500 و 1000 و 2000 خلية لكل بئر. تم إنشاء صور الفاصل الزمني في نقاط زمنية مختلفة لكل بئر لمدة 24 ساعة. تم تحليل كل كروي (الذي كان من عدد معروف من الأميبا) لمنطقة ثنائية الأبعاد ، وتم إنشاء منحنى قياسي كدالة لعدد الأميبا مقابل حجم كروي بمرور الوقت. تكررت هذه التجربة في ثلاث نسخ على الأقل لتعطينا الانحراف المعياري المناسب لأي منحنى ناتج.

تحديد اتجاه الأميبا: في حين أن هذا قد لا يكون ضروريا لدراسات معينة ، فقد يكون من المفيد فهم اتجاه الأميبا. هذا من شأنه أن يوفر بيانات حول الآثار الكيميائية للعلاج أو التجربة. يمكن أيضا استخدام هذه البيانات لإنشاء بيانات مرئية (رسومية) وكمية. يتوفر هذا عبر أداة الانجذاب الكيميائي والترحيل ، وهو مكون إضافي مجاني لبرامج التصوير. وهي متوفرة على الموقع الإلكتروني جنبا إلى جنب مع دليل التطبيق وعينة من الصور والأفلام (انظر جدول المواد).

ديناميكيات الحركة التفصيلية: درست مجموعات أخرى ديناميكيات الانتشار ومسارات الانتشار مع تحليلات إحصائية متقدمة ومتطورة للغاية تتجاوز ما تمت مناقشته هنا^9،10،22. يمكن النظر في هذه بناء على احتياجات المستخدم.

كما هو الحال مع أي طريقة ناجحة ، مر البروتوكول المفصل في هذه المخطوطة بالعديد من جولات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحقيق الاتساق. بينما يمكن إنشاء مقاطع فيديو ممتازة عالية الجودة قابلة للتتبع عن طريق التقاط صورة كل ثانية (أو بأسرع ما يستطيع المجهر ، قد يكون أقل من ثانية) ، فإن هذا يخلق ملفات كبيرة للغاية ، والتي قد يكون من الصعب التعامل معها. هذا مناسب بشكل واقعي فقط لمقاطع الفيديو قصيرة المدى المسجلة لمدة أقصاها بضع دقائق. على العكس من ذلك ، من خلال التقاط صورة كل بضع ثوان ، وجدنا أن سلوك الأميبا لا يزال قابلا للتتبع بناء على سرعة هذا النوع ، ومن الممكن إنشاء مقاطع فيديو قابلة للتطبيق على مدار ساعات أو أيام. لقد وجدنا أن الحد الأقصى لمقدار الوقت بين الصور هو 30 ثانية ، وهو الوقت المطلوب لتتبع الأميبا بدقة بواسطة برنامج التصوير. يجب مراعاة الفاصل الزمني الذي يختاره المستخدم باستخدام القيود المعروفة لمدى سرعة المجهر في تسجيل الصور ، وعدد الصور المطلوبة لكل بئر ، وعدد الآبار التي يتم تسجيلها في كل فترة زمنية. وبالمثل ، تم تحديد المعلمات المذكورة في هذا البروتوكول فيما يتعلق بالحد الأقصى للإزاحة ، وفجوات الإطار المسموح بها ، والحد الأدنى من الإطارات المطلوبة ، وما إلى ذلك ، من خلال التجربة والخطأ من قبل هذا المختبر لإنشاء معلومات المسار التي تتضمن مسارات الأميبا الأكثر اكتمالا وتجاهل الضوضاء الناتجة عن المسارات غير المكتملة ، الأميبا التي تنضم أو تغادر المرحلة في منتصف الفيديو ، أو الأخطاء الناتجة عن ارتباك برامج التصوير مثل عندما تلتقي أميبا في منتصف المسار ثم تنفصل. هذه الأنواع من الأخطاء والمسارات غير المكتملة عالية بشكل مفهوم عند إنشاء مقاطع فيديو طويلة للغاية (من ساعات إلى أيام) للكائنات البيولوجية المجهرية التي تتفاعل باستمرار مع بعضها البعض وهي السبب في أنه يجب رفض جزء كبير جدا من المسارات الخاطئة. تجدر الإشارة إلى أن خطوة ملء الثقوب في البروتوكول ، في تجربة هذا المختبر ، مهمة لتقليل الخطأ في كيفية تتبع برنامج التصوير للأميبا. من خلال التأكد من أن كل أميبا عبارة عن دائرة صلبة بدلا من ، في بعض الأحيان ، دونات أو شكل c ، من المرجح أن يكون البرنامج قادرا على تتبع كل أميبا بنجاح.

علاوة على ذلك ، كما تمت مناقشته ، هناك العديد من المعلمات المتاحة للمستخدم لتحليل صورة أو مقطع فيديو. بناء على الاحتياجات التجريبية ، استفدنا باستمرار أكثر من تحليل المسافة الإجمالية والمسافة القصوى والسرعة والإزاحة. تمت مناقشتها بعمق (بما في ذلك استخدام سلالات وأسطح مختلفة) مع تفسيرات رسومية في المنشورات السابقة^18،19. تسمح هذه المعلمات الأربعة للمستخدم باستقراء قدرة الأميبا على السفر لمسافات خطية والمدة التي يستغرقها للقيام بذلك ، مما يساعد في فهم سلوكهم من حيث صلته بتلوث العدسات اللاصقة. يعد استرداد هذه المعلمات وتحليلها مهمة كبيرة ، كما هو مفصل في أرقامنا. أثناء العمل مع جداول بيانات كبيرة ومتعددة من مخرجات برامج التصوير ، قمنا بالحد من الأخطاء غير المقصودة عن طريق إنشاء قوالب جداول بيانات مقفلة تحسب تلقائيا جميع التحليلات المطلوبة. ومع ذلك ، فإن التحسين المحتمل لهذه الطريقة هو كتابة برنامج نصي يمكنه التعامل مع هذه البيانات وفرزها وتحليلها.

في الختام ، يتم وصف طريقة دقيقة وسهلة الوصول لقياس حجم Acanthamoeba وحركتها في العديد من الظروف المختلفة هنا. لقد أثبتنا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من سلالات الأميبا المختلفة وأوضحنا أنه في حين قد تكون هناك معلمات مباشرة للحصول على معلومات الحركة ، يمكن أن يكون هذا الإعداد التجريبي مصمما بشكل كبير لأي احتياجات محددة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ Ringer’s solution	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers.
10 µL pipette	Eppendorf Research	3123000039	2 µL-20 µL single channel
10 µL pipette tips	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µL Universal Barrier Tip
48 well plate	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene
96-well plate	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411
Axenic culture media (AC6)	Made in house	n/a	Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months.
Centrifuge and appropriate rotor	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min
Chemotaxis and Migration Tool			Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Disposable hemocytometer	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic
ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.)			Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscope, preferably with automated moveable stage	Nikon, Tokyo, Japan		A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time.
NIS-Elements software	Nikon
Serological pipette	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Pipet Controller
Serological pipette tips	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic
Sterile aluminum transmission flow cell	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope
T75 Flasks	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile