Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة الالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري الخلوي للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين.

Abstract

البروتينات أساسية لعلم وظائف الأعضاء البشرية ، مع أهدافها الحاسمة في البحث وتطوير الأدوية. أصبح تحديد أهداف البروتين الحاسمة والتحقق من صحتها جزءا لا يتجزأ من تطوير الأدوية. الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في ارتباط البروتين ، خاصة في سياق التفاعلات المستهدفة للدواء والبروتين. للتحقق التجريبي من الربط والوصول إلى ربط الدواء وهدفه مباشرة ، يتم استخدام طريقة مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA). تهدف هذه الدراسة إلى دمج الالتحام الجزيئي مع CETSA للتنبؤ والتفاعلات بين الأدوية وأهداف البروتين الحيوية والتحقق من صحتها. على وجه التحديد ، توقعنا التفاعل بين بروتين الزانثاتين و Keap1 بالإضافة إلى وضع الربط من خلال تحليل الالتحام الجزيئي ، متبوعا بالتحقق من التفاعل باستخدام مقايسة CETSA. أظهرت نتائجنا أن الزانثاتين يمكن أن ينشئ روابط هيدروجينية مع بقايا أحماض أمينية محددة من بروتين Keap1 ويقلل من الثبات الحراري لبروتين Keap1 ، مما يشير إلى أن الزانثاتين يمكن أن يتفاعل مباشرة مع بروتين Keap1.

Introduction

البروتينات هي جزيئات كبيرة الأهمية في الكائنات الحية وتمتلك مجموعة متنوعة من الوظائف الفريدة داخل الخلايا ، مثل تكوين الغشاء ، وتكوين الهيكل الخلوي ، ونشاط الإنزيم ، والنقل ، وإشارات الخلية ، والمشاركة في كل من الآليات داخل الخلايا وخارجها1،2،3. تظهر البروتينات وظائفها البيولوجية في المقام الأول من خلال تفاعلات محددة مع مجموعة متنوعة من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات الأخرى والأحماض النووية وروابط الجزيئات الصغيرة وأيونات المعادن 1,4. الروابط هي مركبات جزيئية صغيرة ترتبط تحديدا بالبروتينات في الكائن الحي. يحدث التفاعل بين البروتينات والروابط في مواقع محددة على البروتين ، تسمى مواقع الربط ، والمعروفة أيضا باسم جيوب الربط5. في أبحاث الكيمياء الطبية ، يكمن التركيز في تحديد البروتينات الرئيسية المرتبطة بوضوح بالأمراض ، والتي تعمل كأهداف للعقاقير6. لذلك ، فإن اكتساب فهم عميق لمواقع الارتباط بين البروتينات والروابط له أهمية قصوى في تعزيز اكتشاف الأدوية وتصميمها والبحثعنها 7,8.

الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة ارتباط البروتين ، والذي يستخدم الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات والروابط لاستكشاف أنماط الارتباط الأولية والصلات عند تكوين معقدات مستقرة9،10،11. تطبيق تكنولوجيا الالتحام الجزيئي نشأت في سبعينيات القرن العشرين. استنادا إلى مبدأ القفل والاقتران بالمفاتيح واستخدام خوارزميات برامج الإرساء الجزيئي ، يمكن للمرء تحديد التفاعل بين المركبات والأهداف الجزيئية من خلال تحليل نتائج الإرساء. يتيح هذا النهج التنبؤ بمواقع الارتباط النشطة لكل من المركب والجزيء المستهدف. وبالتالي ، فإنه يسهل تحديد شكل الربط الأمثل (يسمى هنا نموذج الربط) لتفاعلات مستقبلات الرباط ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آليات هذه الارتباطات الجزيئية12،13،14،15. بينما يوفر الالتحام الجزيئي تنبؤات قيمة قائمة على الكمبيوتر لتفاعلات مستقبلات الرباط ، من المهم ملاحظة أن هذه نتائج أولية. وبالتالي ، فإن المزيد من التحقق التجريبي ضروري لتأكيد هذه التفاعلات.

يعمل اختبار التحول الحراري الخلوي (CETSA) ، الذي اقترحه في البداية فريق بحث Pär Nordlund في عام 2013 ، كطريقة للتحقق من صحة تفاعلات البروتين المستهدف للدواء. تختبر هذه التقنية على وجه التحديد الاستقرار الحراري للبروتينات المستهدفة الناتجة عن ربط الدواء ، مما يوفر نهجا عمليا لتأكيد التفاعلات الجزيئية16،17،18. يعتمد هذا النهج على المبدأ الأساسي القائل بأن ربط الليجند يبدأ تحولا حراريا داخل البروتينات المستهدفة وينطبق على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك محللات الخلايا والخلايا الحية السليمة والأنسجة19,20. يدعم CETSA المشاركة المستهدفة المباشرة للجزيئات الصغيرة في الخلايا السليمة عن طريق الكشف عن الاستقرار الديناميكي الحراري للبروتينات بسبب ارتباط الرباط وربط الاستجابة المظهرية المرصودة بالمركب المستهدف21,22. من بين المنهجيات المختلفة المستمدة من CETSA ، يعتبر Western Blot-CETSA (WB-CETSA) نهجا كلاسيكيا. بعد تحضير العينة باستخدام طريقة CETSA ، يتم استخدام تحليل اللطخة الغربية للكشف عن التغيرات في الاستقرار الحراري للبروتين المستهدف. هذا يسمح بالتحديد الدقيق لتفاعلات البروتين الدوائي داخل الأنظمة الخلوية 17,23.

Xanthatin هو مركب نشط بيولوجيا معزول من نبات Xanthium L. مع خصائص مثل المضادة للالتهابات ، والتي تم استخدامها في الطب الصيني التقليدي لعلاج أمراض مثل التهاب الجيوب الأنفية والتهاب المفاصل24,25. البروتين 1 المرتبط ب ech الشبيه ب kelch (Keap1) هو أحد مكونات مركب البروتين متعدد الوحدات متعدد الوحدات Cullin-RING E3 ubiquitin ligase القائم على Cullin3 ومنظم مهم لتوازن الأكسدة والاختزال داخل الخلايا ، والذي يؤثر على شدة ومدة الاستجابة الالتهابية عن طريق تعديل حالة الأكسدة والاختزال داخل الخلايا26. في هذه الدراسة ، استخدمنا أولا الالتحام الجزيئي للتحقيق في التفاعل بين الزانثاتين (جزيء صغير) وبروتين Keap1 ، بهدف التنبؤ بوضع الارتباط الخاص بهما. بعد ذلك ، استخدمنا طريقة CETSA للتحقق من صحة هذا التفاعل من خلال تقييم تأثير الزانثاتين على الاستقرار الحراري لبروتين Keap1.

Protocol

1. تنزيل هياكل الزانثاتين و Keap1

  1. افتح قاعدة بيانات PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ، وأدخل زانثاتين (جزيء صغير) ، ثم اضغط على بحث وانقر على النتيجة الأولى. انقر فوق تنزيل وانقر فوق حفظ تحت بنية 2D لحفظ المركب بتنسيق .sdf.
  2. قم بتنزيل التركيب البلوري للبروتين.
    1. افتح قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org/) ، وأدخل Keap1 وانقر فوق بحث. انقر فوق الإنسان تحت الكائنات الحية الشائعة في العمود الأيسر ، ثم انقر فوق الإدخال الأول المسمى Q14145 في العمود الأيمن.
    2. انقر فوق هيكل تحت الوظيفة في العمود الأيسر ، وابحث عن الهيكل باستخدام معرف PDB: 2FLU ، وانقر فوق RCSB-PDB. انقر فوق تنزيل الملفات وحدد تنسيق PDB لتنزيل البنية البلورية لبروتين Keap1.

2. الالتحام الجزيئي

  1. قم بإنشاء مجلد جديد باسم الالتحام الجزيئي على سطح المكتب واحفظ هياكل xanthatin (جزيء صغير) و Keap1 (بروتين) التي تم تنزيلها في هذا المجلد.
    ملاحظة: يجب أن يكون اسم المجلد والمسار باللغة الإنجليزية.
  2. افتح برنامج Maestro ، وانقر فوق ملف ، وحدد تغيير دليل العمل ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا لتحديد مجلد الإرساء الجزيئي الذي تم إنشاؤه حديثا وانقر فوق اختيار خيارات.
  3. معالجة الجزيئات الصغيرة
    1. انقر فوق خيارات هياكل الملفات والاستيراد ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء الجزيئي ، وانقر فوق ملف هيكل xanthatin ، ثم انقر فوق فتح لاستيراد ملف جزيء صغير.
    2. انقر فوق المهام في الزاوية اليمنى العليا من البرنامج وحدد خيار LigPrep . استخدام الهياكل من مساحة العمل ؛ بقية المعلمات هي المعلمات الافتراضية وانقر فوق تشغيل لإجراء معالجة جزيء صغير.
  4. معالجة هيكل البروتين
    1. انقر فوق خيارات هياكل الملفات والاستيراد ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء الجزيئي . انقر فوق ملف بنية البروتين Keap1 ، ثم انقر فوق فتح لاستيراد ملف بنية البروتين.
    2. انقر فوق المهام في الزاوية اليمنى العليا من البرنامج وحدد خيار معالج تحضير البروتين. حدد المربع قبل حذف المياه التي تتجاوز 5 Å من مجموعات Het وأدخل الرقم الهيدروجيني 7.4 +/- 0.0. انقر فوق المعالجة المسبقة، ثم انقر فوق تحسين، ثم انقر فوق تحسين > إزالة المياه > تصغير.
    3. انقر فوق المهمة التالية عند اكتمال المهمة السابقة. انقر فوق المهام وحدد خيار ملف Sitemap ، واستخدم الإعدادات الافتراضية لجميع المعلمات ، وانقر فوق تشغيل.
    4. انقر فوق خيارات هياكل الملفات والاستيراد ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء الجزيئي ، وافتح المجلد المسمى sitemap_1. انقر فوق الملف الأول المسمى Sitemap_1_out.maegz ثم انقر فوق فتح.
    5. انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة لتحديد sitemap_1_protein في مساحة العمل ، ثم انقر فوق Sitemap_1_site_1 لتحديده . انقر فوق المهام وحدد خيار إنشاء شبكة المستقبلات .
      ملاحظة: يتم تصنيف مواقع البروتين التي تنبأت بها خريطة الموقع وفقا للتسجيل ، مع الموقع الأعلى تسجيلا في المقام الأول.
    6. حدد خيار الإدخال ضمن المستقبل ، مع تغيير المعلمات المتبقية. انقر فوق الكرة البيضاء الصغيرة في بنية البروتين لإنشاء صندوق إرساء بالحجم الافتراضي وتغيير اسم الوظيفة إلى grid_2FLU الانزلاق. انقر فوق تشغيل.
  5. الالتحام الجزيئي
    1. انقر فوق المهام وحدد خيار Ligand Docking . حدد شبكة المستقبل ك من الملف وانقر فوق استعراض. انقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الالتحام الجزيئي ، وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف grid_2FLU الانزلاق ، وانقر فوق ملف Glide-grid_2FLU.zip ، ثم انقر فوق فتح.
    2. انقر فوق استخدام الروابط من الملفات > تصفح > سطح المكتب. انقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء الجزيئي ، وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف ligprep_1 ، وانقر فوق ملف Ligprep_1-out.maegz ، ثم انقر فوق فتح.
    3. انقر فوق الإعدادات وحدد خيار الدقة مثل XP (دقة إضافية) ، وقم بتغيير اسم المهمة إلى dock_XP_2FLU الانزلاق ، وانقر فوق تشغيل.
  6. عرض نتائج الإرساء
    1. انقر فوق خيارات الملفات واستيراد الهياكل ، وانقر فوق سطح المكتب ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجلد الإرساء الجزيئي . انقر نقرا مزدوجا فوق ملف dock_XP_2FLU الانزلاق ، وانقر فوق الملف glide-dock_XP_1_pv.maegz ثم انقر فوق فتح.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة لتحديد ligand في مساحة العمل، ثم انقر لتحديد sitemap_1_protein. انقر فوق جدول، ومرر إلى أقصى اليسار، واعرض النتيجة ضمن درجة الإرساء.
  7. تصور نتائج 2D
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة لتحديد ligand في مساحة العمل ، ثم انقر لتحديد sitemap_1_protein أيضا. انقر فوق تفاعل الليجند > عرض وحدد مربع وسيلة إيضاح LID .
    2. انقر فوق ملف ، واختر حفظ لقطة الشاشة ، وأدخل 6000 عند العرض ، وقم بإلغاء تحديد المربع الخاص ب خلفية شفافة ، وانقر فوق موافق. انقر فوق سطح المكتب ، وقم بتسمية الملف باسم 2D-xanthatin-2FLU ، واحفظ الصورة.
  8. تصور نتائج 3D
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة لتحديد ligand في مساحة العمل ، ثم انقر لتحديد sitemap_1_protein أيضا.
    2. انقر L في التحديد السريع لتحديد جزيئات صغيرة، ثم انقر فوق نمط. انقر فوق السطر الثاني في النمط لتغيير حجم رابطة الجزيء الصغيرة وانقر فوق ذرات اللون لتغيير لون الجزيء الصغير.
    3. حدد الجزيء الصغير في الشكل ، وانقر فوق زر الماوس الأيمن ، وحدد توسيع التحديد ، واختر 4 Å. انقر فوق تطبيق التسميات بالنمط لعرض التسميات.
    4. انقر فوق السطر الثاني في النمط لتغيير حجم روابط الأحماض الأمينية وانقر فوق Color Atoms لتغيير لون الأحماض الأمينية.
    5. انقر فوق Next > Invert ، واضغط باستمرار على مفتاح التحكم وانقر على موضع العين الأول تحت النمط لإظهار الأحماض الأمينية فقط مع الملصقات.
    6. انقر فوق Style > Ribbons لإظهار البروتين كنمط شريط وانقر فوق تحرير الشريط أسفل الشرائط لتغيير لون الشريط.
    7. انقر فوق تبديل التفاعلات في الركن الأيمن السفلي من الشاشة ، وانقر فوق زر الماوس الأيمن وقم بإلغاء تحديد جهات الاتصال / الاشتباكات.
    8. ابحث عن القياس في المهام ، وحدد المسافة ، وانقر فوق الذرتين المتصلتين بالخط الأصفر المنقط (الرابطة الهيدروجينية) في الشاشة لقياس أطوال الروابط الهيدروجينية.
    9. اضغط مع الاستمرار على عجلة الماوس لتدوير البروتين ، واضبط البروتين على وسط الشاشة ، وتأكد من أن كل ملصق من الأحماض الأمينية مرئي.
    10. انقر فوق مساحة العمل > حفظ الصورة باسم وانقر على سطح المكتب. احفظ الصورة بدقة 600 نقطة في البوصة افتراضيا ، وقم بتسمية الملف باسم 3D-xanthatin-2FLO ، واختر نوع الملف بتنسيق tiff ، واحفظ الصورة.

3. زراعة الخلايا وإعداد عينة CETSA

  1. زراعة الخلايا
    1. أضف 5 × 106 خلايا RAW264.7 / مل في طبق استزراع 100 مم واحتضانها ب 6 مل من وسط DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ محلول مضاد حيوي مضاد حيوي عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2. قم بإعداد ثلاثة أطباق وإجراء التجربة عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
  2. إعداد عينة CETSA
    1. نضح الوسط القديم ، أضف 2 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) تم تسخينه إلى درجة حرارة الغرفة لكل طبق ، واغسل 2x.
    2. أضف 2 مل من PBS إلى كل طبق من الخلايا ، وامزج الخلايا ، واجمع الخلايا في أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 377 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 2 مل من PBS تحتوي على 1٪ من مخاليط مثبطات الأنزيم البروتيني واسع الطيف. تقسم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية مع 1 مل من تعليق الخلية في كل منها.
    4. قم بتجميد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في النيتروجين السائل حتى تصبح صلبة بيضاء ، ثم تذوب على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية وكرر 3x. جهاز طرد مركزي عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    5. خذ أنبوبي طرد مركزي دقيقين ، أحدهما يحتوي على 100 ميكرومتر زانثاتين والآخر بحجم متساو من DMSO ، وأضف 450 ميكرولتر من طافي الطرد المركزي إلى كل أنبوب ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. أضف المادة الطافية من أنبوبي الطرد المركزي الدقيق إلى 14 أنبوب PCR بحجم 60 ميكرولتر / أنبوب ، وأنابيب الحرارة في وقت واحد عند درجات حرارة متفاوتة (45 درجة مئوية ، 48 درجة مئوية ، 51 درجة مئوية ، 54 درجة مئوية ، 57 درجة مئوية ، 60 درجة مئوية و 63 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق ، مع أنبوبي تفاعل البوليميراز المتسلسل عند كل درجة حرارة ، لمجموعات DMSO و xanthain ، على التوالي.
    7. بالنسبة للمجموعة غير المسخنة ، خذ مادة طاف من كل من أنبوبي الطرد المركزي الدقيق وأضفها إلى 14 أنبوبا PCR ، 7 لمجموعة DMSO و 7 لمجموعة الزانثاتين ، بحجم 60 ميكرولتر لكل منهما. لا تسخن العينات هنا.
    8. تبريد الأنابيب في درجة حرارة الغرفة للمجموعة الساخنة. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب (ساخنة وغير ساخنة) عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وأخذ 48 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. أضف 12 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE إلى كل أنبوب ، دوامة للخلط جيدا ، وقم بتسخينها في حمام مائي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يجب تخزين عينات CETSA المحضرة عند -80 °C واختبارها بواسطة اللطخة الغربية في غضون أسبوع 1.

4. لطخة الغربية

  1. إعداد جل SDS-PAGE
    1. شطف لوحة زجاجية طويلة وقصيرة واحدة بالماء النقي للغاية. ضع الألواح في فتحة التثبيت ، ثم على لوح شفاف. أضف الماء عالي النقاء وتحقق من التسرب لمدة 10 دقائق.
    2. أضف 8 مل من محلول الجل السفلي و 8 مل من محلول الجل السفلي في دورق مخروطي واخلطه عن طريق رجه برفق. أضف 160 ميكرولتر من مروج التخثر إلى محلول الجل واخلطه جيدا.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز حجم الطبقة السفلية من المادة اللاصقة الخط الأخضر على فتحة التثبيت.
    3. قم بتصريف المياه فائقة النقاء من الألواح وامسحها حتى تجف بورق الترشيح. أضف محلول الجل السفلي المحضر. أضف 2 مل من كحول الأيزوبروبيل وانتظر لمدة 20 دقيقة للتصلب.
    4. خذ 2 مل من محلول الجل العلوي و 2 مل من محلول الجل العلوي في دورق مخروطي واخلطه عن طريق هز القارورة برفق.
    5. قم بإزالة كحول الأيزوبروبيل من طبقة الهلام وصمة عار كحول الأيزوبروبيل الزائد بورق الترشيح.
    6. أضف 40 ميكرولتر من محفز التخثر إلى محلول الجل العلوي المختلط ، واخلطه جيدا ، ثم أضفه بين الألواح الزجاجية الطويلة والقصيرة وأدخل مشطا 1.5 مم من 15 حفرة ، وانتظر لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إدخال المشط بشكل عمودي على الطبقة العليا ، مع عدم وجود فقاعات هواء بين المشط والمحلول.
  2. الكهربائي
    1. أضف 1 لتر من الماء عالي النقاء إلى دورق ، وأضف كيسا من مسحوق SDS-PAGE العازل ، وحركه جيدا بقضيب زجاجي ، وأضف الجل المحضر إلى وحدة الرحلان الكهربائي. ضع الوحدة في الصندوق واسحب المشط.
    2. علامة ذوبان الجليد وعينات CETSA في درجة حرارة الغرفة ، دوامة ، وتدور لأسفل. أضف 2.5 ميكرولتر من العلامة إلى البئر الأول و 20 ميكرولتر من عينات CETSA إلى كل من الآبار المتبقية وفقا للتسلسل المحدد مسبقا.
      ملاحظة: تمت إضافة عينات CETSA على التوالي وفقا للمعالجة الحرارية الموصوفة في الخطوة 3.2.6 من 45 درجة مئوية إلى 63 درجة مئوية ؛ تمت إضافة مجموعة DMSO أولا ، ثم مجموعة xanthatin (الشكل 1).
    3. أضف محلول الرحلان الكهربائي المتبقي إلى وحدة الرحلان الكهربائي ، وأغلق الغطاء ، وأدخل القطب ، والقطب الموجب إلى القطب الموجب ، والقطب السالب إلى القطب السالب.
    4. قم بتشغيل مفتاح الطاقة واضبط مفتاح الجهد على 80 فولت لبدء الرحلان الكهربائي.
  3. نقل إلى الغشاء
    1. أضف 850 مل من الماء فائق النقاء ، و 100 مل من الإيثانول اللامائي ، و 50 مل من محلول النقل السريع إلى دورق وقلبه جيدا. تحضير ألواح الرغوة والسكاكين البلاستيكية والملاقط والصواني وأجهزة نقل الأغشية.
    2. قم بقطع غشاء PVDF وفقا لحجم الجل ، وقم بتمييزه ، وانقعه في الميثانول لمدة 30 ثانية لتنشيطه.
    3. صب محلول النقل في الدرج ، وضع مشابك النقل وافتحها ، وضع وسادة إسفنجية وثلاث طبقات من ورق ترشيح النقل.
    4. أوقف الرحلان الكهربائي ثم افتح غطاء صندوق الرحلان الكهربائي. خذ جهاز الكهربائي ، واسكب محلول الرحلان الكهربائي ، وأزل اللوحة. ضع اللوحة على لوح الرغوة ، ثم أخرجها برفق بسكين بلاستيكي ، واقطع الجل لتصور علامة البروتين والبروتينات المستهدفة بوضوح.
    5. امسك جانبا واحدا من العلامة بملاقط ، واغسله في صينية تحتوي على محلول الغشاء ، وضعه بشكل مسطح على ورق الترشيح. اغمس غشاء PVDF المنشط في محلول النقل ، وأمسك الجانب المسمى بملاقط ، وقم بتغطية الجل ووجهه لأسفل.
      ملاحظة: الجانب المميز بغشاء PVDF هو الجانب الأمامي وانتبه إلى حقيقة أنه لا يتم إنشاء فقاعات أثناء عملية التنسيب.
    6. ضع طبقتين من ورق ترشيح النقل وطبقة واحدة من وسادة الإسفنج على غشاء PVDF ، وقم بتغطية مشابك النقل وتثبيتها ، وضعها في خزان النقل.
      ملاحظة: اللون الأسود لمقطع النقل إلى اللون الأسود لفتحة النقل.
    7. أضف المحلول المتبقي عبر الغشاء إلى الكاسيت عبر الغشاء ، وقم بتغطيته بالغطاء ، من الموجب إلى الإيجابي ، من السلبي إلى السلبي.
    8. اضبط التيار على 400 مللي أمبير ، والوقت إلى 30 دقيقة ، ثم اضغط على تشغيل لبدء نقل الغشاء في درجة حرارة الغرفة.
  4. حظر
    1. أضف 2 لتر من الماء عالي النقاء إلى قنينة زجاجية ، وأضف كيسا من مسحوق TBS ، ثم أضف 2 مل من Tween لصنع محلول TBST. قم بوزن مسحوق BSA لتحضير محلول BSA بنسبة 5٪ مع TBST وأضف 6 مل من محلول BSA إلى صندوق الحضانة.
    2. أوقف نقل الغشاء ثم افتح مشبك النقل. قم بتثبيت جانب العلامة من غشاء PVDF وضعه في صندوق الحضانة. ضع صندوق الحضانة على شاكر وكتلة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. قم بإعداد الجسم المضاد الأساسي (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) بمحلول 5٪ BSA عند 1: 1000 ، وأعد تدوير محلول BSA في صندوق الحاضنة ، وأضف 6 مل من الجسم المضاد الأولي إلى صندوق الحضانة. ضع صندوق الحضانة في صندوق رغوي به أكياس ثلج واحتفظ به على شاكر طوال الليل.
  6. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. اجمع الجسم المضاد الأساسي في صندوق الحضانة في اليوم التالي ، ثم أضف 6 مل من محلول TBST وضعه على شاكر لغسله لمدة 5 دقائق.
    2. اسكب محلول TBST المغسول وأضفه طازجا للغسيل ؛ كرر 5x وقم بإعداد الجسم المضاد الثانوي بمحلول 5٪ BSA عند 1: 5000.
    3. اسكب محلول TBST وأضف 6 مل من الأجسام المضادة الثانوية إلى صندوق الحضانة. ضع صندوق الحضانة على شاكر واحتضانه لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. اجمع الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، ثم أضف 6 مل من محلول TBST وضعه على شاكر لغسله لمدة 5 دقائق. اسكب محلول TBST المغسول وأضفه طازجا للغسيل ؛ كرر 5x.
  7. فضح الشرائط
    1. احتفظ بمحلول TBST في نهاية آخر غسلة. خذ كميات متساوية من الكواشف الكيميائية A و B ، اهتز ، واخلط جيدا. احم المحلول من الضوء.
    2. افتح نظام التصوير الهلامي ، وانقر فوق عينات ، وتحقق من المعايرة ، وانتظر حتى تكتمل المعايرة ، ثم انقر فوق علامة ، وتحقق من المعايرة.
    3. التقط جانب العلامة من الشريط بملاقط وانغمس تماما في محلول الكاشف الكيميائي. قم بتثبيت جانب واحد من العلامة لوضع الشريط ووجهه لأسفل في جهاز التصوير ، وأغلق غطاء جهاز التصوير ، وانقر فوق التعرض ، واضبط وقت التعرض على 1 ثانية.
      ملاحظة: يجب على المطور تغطية الشريط بالكامل ، ويجب أن يكون التطوير في بيئة مظلمة.
    4. انقر فوق حفظ، وقم بتسمية الصورة، واحفظها كملف .tif. تحليل الكثافة البصرية للوصمة الغربية. تمت مقارنة القيم الرمادية لكل درجة حرارة في مجموعة DMSO مع القيم الرمادية البالغة 45 درجة مئوية ، وتمت مقارنة القيم الرمادية لكل درجة حرارة في مجموعة الزانثاتين مع القيم الرمادية للزانثاتين عند 45 درجة مئوية.

النتائج

توقع تحليل الالتحام الجزيئي التفاعل بين الزانثاتين وبروتين Keap1. يوضح الشكل 2 تكوين روابط هيدروجينية بين الزانثاتين وبقايا الأحماض الأمينية Gly-367 و Val-606 من بروتين Keap1 ، بطول رابطة هيدروجينية يبلغ 2.17 Å ل Gly-367 و 2.13 Å ل Val-606. بالإضافة إلى ذلك ، تشير درجة الالتحام المحسوبة البالغة -5...

Discussion

يرتبط تحديد أهداف المرض واكتشاف الأدوية وتطويرها ارتباطا وثيقا27. من خلال استهداف أهداف محددة بدقة ، يمكن تطوير الأدوية المرشحة لعلاج أمراض معينة بشكل أكثر فعالية مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية28,29 في نفس الوقت. الأهداف الأكثر استخ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82004031) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022NSFSC1303). نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي صن في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في اللطخة الغربية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membraneMilliporePR05509
Anhydrous ethanolChron chemicals64-17-5
Bovine serum albuminBioFroxx4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixturesBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Enhanced chemiluminescence reagentBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH antibodyProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Gel Imaging InstrumentE-BLOTTouch Imager Pro
Gradient PCR instrumentBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifugeBeckman CoulterAllegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibodyProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Isopropyl alcohol Chron chemicals67-63-0
Keap1 antibodyZen BioScience Co., LtdR26935
Metal bathAnalytik JenaTSC
MethanolChron chemicals67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Phosphate buffer salineBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Prestained Color Protein MarkerBiosharp BL741A
Protein Blotting Electrophoresis SystemBio-RadMiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cellBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 cell-specific mediumProcell Life Science&Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE protein loading bufferBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018
Tris buffered saline powderServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Water bathMemmertWNE10
Water purifierMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

References

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
  3. Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
  4. Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
  5. Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
  6. Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
  7. Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
  8. Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
  9. Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
  10. Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
  11. Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
  12. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  13. Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
  14. Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
  15. Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
  16. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  17. Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
  18. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  19. Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
  20. Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
  21. Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
  22. Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
  23. Tolvanen, T. A. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).
  24. Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
  25. Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
  26. Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
  27. Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
  28. Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  29. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  30. Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
  31. Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
  32. Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
  33. Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
  34. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
  35. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved