A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة الالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري الخلوي للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين.

Abstract

البروتينات أساسية لعلم وظائف الأعضاء البشرية ، مع أهدافها الحاسمة في البحث وتطوير الأدوية. أصبح تحديد أهداف البروتين الحاسمة والتحقق من صحتها جزءا لا يتجزأ من تطوير الأدوية. الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في ارتباط البروتين ، خاصة في سياق التفاعلات المستهدفة للدواء والبروتين. للتحقق التجريبي من الربط والوصول إلى ربط الدواء وهدفه مباشرة ، يتم استخدام طريقة مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA). تهدف هذه الدراسة إلى دمج الالتحام الجزيئي مع CETSA للتنبؤ والتفاعلات بين الأدوية وأهداف البروتين الحيوية والتحقق من صحتها. على وجه التحديد ، توقعنا التفاعل بين بروتين الزانثاتين و Keap1 بالإضافة إلى وضع الربط من خلال تحليل الالتحام الجزيئي ، متبوعا بالتحقق من التفاعل باستخدام مقايسة CETSA. أظهرت نتائجنا أن الزانثاتين يمكن أن ينشئ روابط هيدروجينية مع بقايا أحماض أمينية محددة من بروتين Keap1 ويقلل من الثبات الحراري لبروتين Keap1 ، مما يشير إلى أن الزانثاتين يمكن أن يتفاعل مباشرة مع بروتين Keap1.

Introduction

البروتينات هي جزيئات كبيرة الأهمية في الكائنات الحية وتمتلك مجموعة متنوعة من الوظائف الفريدة داخل الخلايا ، مثل تكوين الغشاء ، وتكوين الهيكل الخلوي ، ونشاط الإنزيم ، والنقل ، وإشارات الخلية ، والمشاركة في كل من الآليات داخل الخلايا وخارجها1،2،3. تظهر البروتينات وظائفها البيولوجية في المقام الأول من خلال تفاعلات محددة مع مجموعة متنوعة من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات الأخرى والأحماض النووية وروابط الجزيئات الصغيرة وأيونات المعادن 1,4. الروابط هي مركبات جزيئية صغيرة ترتبط تحديدا بالبروتينات في الكائن الحي. يحدث التفا....

Protocol

1. تنزيل هياكل الزانثاتين و Keap1

  1. افتح قاعدة بيانات PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ، وأدخل زانثاتين (جزيء صغير) ، ثم اضغط على بحث وانقر على النتيجة الأولى. انقر فوق تنزيل وانقر فوق حفظ تحت بنية 2D لحفظ المركب بتنسيق .sdf.
  2. قم بتنزيل التركيب البلوري للبروتين.
    1. افتح قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org/) ، وأدخل Keap1 وانقر فوق بحث. انقر فوق الإنسان تحت الكائنات الحية الشائعة في العمود الأيسر ، ثم انقر فوق الإدخال الأول المسمى Q14145 في العمود الأيمن.
    2. انقر فوق هيكل

النتائج

توقع تحليل الالتحام الجزيئي التفاعل بين الزانثاتين وبروتين Keap1. يوضح الشكل 2 تكوين روابط هيدروجينية بين الزانثاتين وبقايا الأحماض الأمينية Gly-367 و Val-606 من بروتين Keap1 ، بطول رابطة هيدروجينية يبلغ 2.17 Å ل Gly-367 و 2.13 Å ل Val-606. بالإضافة إلى ذلك ، تشير درجة الالتحام المحسوبة البالغة -5.......

Discussion

يرتبط تحديد أهداف المرض واكتشاف الأدوية وتطويرها ارتباطا وثيقا27. من خلال استهداف أهداف محددة بدقة ، يمكن تطوير الأدوية المرشحة لعلاج أمراض معينة بشكل أكثر فعالية مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية28,29 في نفس الوقت. الأهداف الأكثر استخ?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82004031) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022NSFSC1303). نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي صن في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في اللطخة الغربية.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membraneMilliporePR05509
Anhydrous ethanolChron chemicals64-17-5
Bovine serum albuminBioFroxx4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixturesBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Enhanced chemiluminescence reagentBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH antibodyProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Gel Imaging InstrumentE-BLOTTouch Imager Pro
Gradient PCR instrumentBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifugeBeckman CoulterAllegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibodyProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Isopropyl alcohol Chron chemicals67-63-0
Keap1 antibodyZen BioScience Co., LtdR26935
Metal bathAnalytik JenaTSC
MethanolChron chemicals67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Phosphate buffer salineBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Prestained Color Protein MarkerBiosharp BL741A
Protein Blotting Electrophoresis SystemBio-RadMiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cellBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 cell-specific mediumProcell Life Science&Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE protein loading bufferBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018
Tris buffered saline powderServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Water bathMemmertWNE10
Water purifierMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

References

  1. Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
  2. Du, X., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved