Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen

Zusammenfassung

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem zellulären thermischen Shift-Assay, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Zusammenfassung

Proteine sind für die menschliche Physiologie von grundlegender Bedeutung, wobei ihre Ziele für die Forschung und Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung sind. Die Identifizierung und Validierung wichtiger Proteinziele ist zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung geworden. Molekulares Docking ist ein computergestütztes Werkzeug, das häufig zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung eingesetzt wird, insbesondere im Zusammenhang mit Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Proteinzielen. Für die experimentelle Verifizierung der Bindung und um direkt auf die Bindung des Wirkstoffs und seines Ziels zuzugreifen, wird die Methode des Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) verwendet. Diese Studie zielte darauf ab, molekulares Docking mit CETSA zu integrieren, um Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und lebenswichtigen Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren. Konkret haben wir die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein sowie dessen Bindungsmodus durch molekulare Docking-Analyse vorhergesagt, gefolgt von der Verifizierung der Interaktion mit dem CETSA-Assay. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Xanthatin Wasserstoffbrückenbindungen mit spezifischen Aminosäureresten des Keap1-Proteins aufbauen und die Thermostabilität des Keap1-Proteins verringern kann, was darauf hindeutet, dass Xanthatin direkt mit dem Keap1-Protein interagieren kann.

Einleitung

Proteine sind äußerst wichtige Makromoleküle in lebenden Organismen und besitzen eine Vielzahl einzigartiger Funktionen innerhalb von Zellen, wie z. B. die Membranzusammensetzung, die Bildung des Zytoskeletts, die Enzymaktivität, den Transport, die Zellsignalisierung und die Beteiligung an intrazellulären und extrazellulären Mechanismen ^1,2,3. Proteine manifestieren ihre biologischen Funktionen in erster Linie durch spezifische Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Molekülen, einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, niedermolekularer Liganden und Metallionen

Protokoll

1. Herunterladen der Strukturen von Xanthatin und Keap1

1. Öffnen Sie die PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), geben Sie Xanthatin (kleines Molekül) ein, drücken Sie dann auf Suchen und klicken Sie auf Das erste Ergebnis. Klicken Sie auf Herunterladen und klicken Sie auf Speichern unter 2D-Struktur, um die Verbindung im .sdf-Format zu speichern.
2. Laden Sie die Kristallstruktur des Proteins herunter.
   1. Öffnen Sie die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/), geben Sie Keap1 ein und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in der li....

Diskussion

Die Identifizierung von Krankheitszielen sowie die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten sind eng miteinander verknüpft²⁷. Durch die präzise Ausrichtung auf spezifische Ziele können Wirkstoffkandidaten entwickelt werden, um bestimmte Krankheiten effektiver zu behandeln und gleichzeitig die mit den Medikamenten verbundenen Nebenwirkungen zu minimieren ^28,29. Die am häufigsten verwendeten Ziele sind Proteinziele^30.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706