Prédiction et validation de cibles protéiques de composés à petites molécules

Résumé

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à un test de décalage thermique cellulaire pour prédire et valider l’interaction entre les petites molécules et les cibles protéiques.

Résumé

Les protéines sont fondamentales pour la physiologie humaine, leurs cibles étant cruciales dans la recherche et le développement de médicaments. L’identification et la validation de cibles protéiques cruciales font désormais partie intégrante du développement de médicaments. L’amarrage moléculaire est un outil informatique largement utilisé pour étudier la liaison protéine-ligand, en particulier dans le contexte des interactions médicamenteuses et protéiques cibles. Pour la vérification expérimentale de la liaison et pour accéder directement à la liaison du médicament et de sa cible, la méthode CETSA (Cellular Thermal Shift Astesty) est utilisée. Cette étude visait à intégrer l’amarrage moléculaire à CETSA pour prédire et valider les interactions entre les médicaments et les cibles protéiques vitales. Plus précisément, nous avons prédit l’interaction entre la xanthatine et la protéine Keap1 ainsi que son mode de liaison par analyse d’amarrage moléculaire, suivie d’une vérification de l’interaction à l’aide du test CETSA. Nos résultats ont démontré que la xanthatine pouvait établir des liaisons hydrogène avec des résidus d’acides aminés spécifiques de la protéine Keap1 et réduire la thermostabilité de la protéine Keap1, indiquant que la xanthatine pouvait interagir directement avec la protéine Keap1.

Introduction

Les protéines sont des macromolécules très importantes dans les organismes vivants et possèdent une gamme variée de fonctions uniques au sein des cellules, telles que la composition membranaire, la formation du cytosquelette, l’activité enzymatique, le transport, la signalisation cellulaire et l’implication dans les mécanismes intracellulaires et extracellulaires ^1,2,3. Les protéines manifestent leurs fonctions biologiques principalement par des interactions spécifiques avec une variété de molécules, y compris d’autres protéines, des acides nucléiques, des ligands de petites ....

Protocole

1. Téléchargement des structures de xanthatine et Keap1

1. Ouvrez la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), entrez xanthatine (petite molécule), puis appuyez sur Rechercher et cliquez sur Le premier résultat. Cliquez sur Télécharger et cliquez sur Enregistrer sous la structure 2D pour enregistrer le composé au format .sdf.
2. Téléchargez la structure cristalline de la protéine.
   1. Ouvrez la base de données UniProt (https://www.uniprot.org/), saisissez Keap1 et cliquez sur Rechercher. Cliquez sur Humain sous orga....

Discussion

L’identification de cibles pathologiques et la découverte et la mise au point de médicaments sont étroitement liées²⁷. En ciblant précisément des cibles spécifiques, des candidats-médicaments peuvent être développés pour traiter plus efficacement des maladies particulières tout en minimisant les effets secondaires associés aux médicaments^28,29. Les cibles les plus couramment utilisées sont les cibles protéiques

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706