Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

Özet

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Özet

Proteinler insan fizyolojisi için temeldir ve hedefleri araştırma ve ilaç geliştirmede çok önemlidir. Önemli protein hedeflerinin tanımlanması ve doğrulanması, ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Moleküler yerleştirme, özellikle ilaç ve protein hedef etkileşimleri bağlamında, protein-ligand bağlanmasını araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır. Bağlanmanın deneysel olarak doğrulanması ve ilacın ve hedefinin bağlanmasına doğrudan erişmek için hücresel termal kayma testi (CETSA) yöntemi kullanılır. Bu çalışma, ilaçlar ve hayati protein hedefleri arasındaki etkileşimleri tahmin etmek ve doğrulamak için moleküler yerleştirmeyi CETSA ile entegre etmeyi amaçladı. Spesifik olarak, ksantatin ve Keap1 proteini arasındaki etkileşimi ve moleküler yerleştirme analizi yoluyla bağlanma modunu tahmin ettik ve ardından CETSA tahlili kullanılarak etkileşimin doğrulanmasını izledik. Sonuçlarımız, ksantatinin Keap1 proteininin spesifik amino asit kalıntıları ile hidrojen bağları kurabildiğini ve Keap1 proteininin termostabilitesini azaltabildiğini gösterdi, bu da ksantatinin Keap1 proteini ile doğrudan etkileşime girebileceğini gösterdi.

Giriş

Proteinler, canlı organizmalarda son derece önemli makromoleküllerdir ve hücreler içinde zar bileşimi, hücre iskeleti oluşumu, enzim aktivitesi, taşıma, hücre sinyalizasyonu ve hem hücre içi hem de hücre dışı mekanizmalarda yer alma gibi çok çeşitli benzersiz işlevlere sahiptir ^1,2,3. Proteinler biyolojik işlevlerini esas olarak diğer proteinler, nükleik asitler, küçük moleküllü ligandlar ve^{metal iyonları 1,4} dahil olmak üzere çeşitli moleküllerle spesifik etkileşimler yoluyla gösterirler. Ligandlar, bir organizmadaki....

Protokol

1. Xanthatin ve Keap1 yapılarının indirilmesi

1. PubChem veritabanını (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) açın, ksantatın (küçük molekül) girin, ardından Ara'ya basın ve İlk Sonuç'a tıklayın. Bileşiği .sdf formatında kaydetmek için İndir'e tıklayın ve 2B yapı altında Kaydet'e tıklayın.
2. Proteinin kristal yapısını indirin.
   1. UniProt veritabanını (https://www.uniprot.org/) açın, Keap1 girin ve Ara'ya tıklayın. Sol sütundaki popüler organizmalar altında İnsan'a tıklayın ve ardından sağ sütundaki Q14145 Adlı İlk Giriş'e

Tartışmalar

Hastalık hedeflerinin belirlenmesi ve ilaçların keşfi ve geliştirilmesi birbiriyle yakından bağlantılıdır²⁷. Spesifik hedefleri tam olarak hedefleyerek, ilaçlarla ilişkili yan etkileri en aza indirirken aynı zamanda belirli hastalıkları daha etkili bir şekilde tedavi etmek için ilaç adayları geliştirilebilir^28,29. En sık kullanılan hedefler protein hedefleridir³⁰. Bununla birlikte, özel protei.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706