Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

Riepilogo

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con il saggio di spostamento termico cellulare per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole e bersagli proteici.

Abstract

Le proteine sono fondamentali per la fisiologia umana, con i loro bersagli cruciali nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. L'identificazione e la convalida di bersagli proteici cruciali sono diventate parte integrante dello sviluppo di farmaci. Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per studiare il legame proteina-ligando, specialmente nel contesto delle interazioni farmaco-bersaglio proteico. Per la verifica sperimentale del legame e per accedere direttamente al legame del farmaco e del suo bersaglio, viene utilizzato il metodo del saggio di spostamento termico cellulare (CETSA). Questo studio mirava a integrare il docking molecolare con CETSA per prevedere e convalidare le interazioni tra farmaci e bersagli proteici vitali. In particolare, abbiamo previsto l'interazione tra xantilina e proteina Keap1 e la sua modalità di legame attraverso l'analisi di docking molecolare, seguita dalla verifica dell'interazione utilizzando il saggio CETSA. I nostri risultati hanno dimostrato che la xantilina potrebbe stabilire legami idrogeno con specifici residui amminoacidici della proteina Keap1 e ridurre la termostabilità della proteina Keap1, indicando che la xantilina potrebbe interagire direttamente con la proteina Keap1.

Introduzione

Le proteine sono macromolecole molto importanti negli organismi viventi e possiedono una vasta gamma di funzioni uniche all'interno delle cellule, come la composizione della membrana, la formazione del citoscheletro, l'attività enzimatica, il trasporto, la segnalazione cellulare e il coinvolgimento nei meccanismi intracellulari ed extracellulari ^1,2,3. Le proteine manifestano le loro funzioni biologiche principalmente attraverso interazioni specifiche con una varietà di molecole, tra cui altre proteine, acidi nucleici, ligandi di piccole molecole e ioni metallici

Protocollo

1. Scaricare le strutture di xantalina e Keap1

1. Apri il database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), inserisci xantalina (piccola molecola), quindi premi Cerca e fai clic su Il primo risultato. Fare clic su Download e fare clic su Salva sotto struttura 2D per salvare il composto in formato .sdf.
2. Scarica la struttura cristallina della proteina.
   1. Aprire il database UniProt (https://www.uniprot.org/), immettere Keap1 e fare clic su Cerca. Fare clic su Umano sotto organismi popolari nella colonna di sinistra, quindi fare ....

Discussione

L'identificazione dei bersagli della malattia e la scoperta e lo sviluppo di farmaci sono strettamente interconnessi²⁷. Mirando con precisione a bersagli specifici, è possibile sviluppare farmaci candidati per trattare particolari malattie in modo più efficace, riducendo al minimo gli effetti collaterali associati ai farmaci^28,29. I bersagli più comunemente usati sono i bersagli proteici³⁰. Tuttavia, l'identifica.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706