小分子化合物的蛋白质靶点预测与验证

摘要

这里使用的实验展示了一种分子对接结合细胞热位移测定的方法，以预测和验证小分子和蛋白质靶标之间的相互作用。

摘要

蛋白质是人体生理学的基础，其靶点在研究和药物开发中至关重要。关键蛋白质靶标的识别和验证已成为药物开发不可或缺的一部分。分子对接是一种广泛用于研究蛋白质-配体结合的计算工具，特别是在药物和蛋白质靶标相互作用的背景下。为了进行结合的实验验证并直接获得药物与其靶标的结合，使用细胞热位移测定 （CETSA） 方法。本研究旨在将分子对接与CETSA相结合，以预测和验证药物与重要蛋白质靶点之间的相互作用。具体来说，我们通过分子对接分析预测了xanthatin和Keap1蛋白之间的相互作用及其结合模式，然后使用CETSA法验证了该相互作用。结果表明，黄素可以与Keap1蛋白的特定氨基酸残基建立氢键，降低Keap1蛋白的热稳定性，表明黄素可以直接与Keap1蛋白相互作用。

引言

蛋白质是生物体中非常重要的大分子，在细胞内具有多种独特的功能，例如膜组成、细胞骨架形成、酶活性、运输、细胞信号传导以及参与细胞内和细胞外机制 ^1,2,3。蛋白质主要通过与多种分子的特异性相互作用来表现出其生物学功能，包括其他蛋白质、核酸、小分子配体和金属离子 ^1,4。配体是与生物体中的蛋白质特异性结合的小分子化合物。蛋白质和配体之间的相互作用发生在蛋白质上的特定位点，称为结合位点，也称为结合口袋⁵。在药物化学研究中，重点在于识别与疾病明显相关的关键蛋白质，这些蛋白质是药物的靶标⁶。因此，深入了解蛋白质和配体之间的结合位点对于促进药物发现、设计和研究至关重要^7,8。

分子对接是一种广泛使用的用于研究蛋白质-配体结合的计算工具，它利用蛋白质和配体的三维结构来探索它们在形成稳定复合物时的主要结合模式和亲和力

研究方案

1. 下载 xanthatin 和 Keap1 的结构

1. 打开 PubChem 数据库 （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），输入 xanthatin（小分子），然后按 搜索并单击 第一个结果。单击“ 下载 ”，然后单击“2D结构”下的“ 保存 ”，以.sdf格式保存化合物。
2. 下载蛋白质的晶体结构。
   1. 打开 UniProt 数据库 （https://www.uniprot.org/），输入 Keap1 并点击搜索。单击左列中“流行生物”下的“ 人类 ”，然后单击右列中的“ 名为 Q14145 的第一个条目 ”。
   2. 单击左列函数下的 Structure ，找到 PDB ID 为 2FLU 的结构，然后单击 RCSB-PDB。单击“ 下载文件 ”并选择 “PDB 格式 ”以下载 Keap1 蛋白的晶体结构。

2. 分子对接

讨论

疾病靶点的确定与药物的发现和开发密切相关²⁷.通过精确靶向特定靶点，可以开发候选药物以更有效地治疗特定疾病，同时最大限度地减少与药物相关的副作用^28,29。最常用的靶标是蛋白质靶标³⁰。然而，由于细胞内蛋白质的广泛多样性，特殊蛋白质靶标的鉴定带来了巨大的挑战^30,31

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706