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  • Resumen
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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico celular para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

Resumen

Las proteínas son fundamentales para la fisiología humana, y sus objetivos son cruciales en la investigación y el desarrollo de fármacos. La identificación y validación de dianas proteicas cruciales se ha convertido en una parte integral del desarrollo de fármacos. El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para investigar la unión proteína-ligando, especialmente en el contexto de las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Para la verificación experimental de la unión y para acceder directamente a la unión del fármaco y su diana, se utiliza el método de ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA). Este estudio tuvo como objetivo integrar el acoplamiento molecular con CETSA para predecir y validar las interacciones entre fármacos y dianas proteicas vitales. En concreto, predijimos la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1, así como su modo de unión, mediante un análisis de acoplamiento molecular, seguido de la verificación de la interacción mediante el ensayo CETSA. Nuestros resultados demostraron que la xanthatina podía establecer enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos específicos de la proteína Keap1 y reducir la termoestabilidad de la proteína Keap1, lo que indica que la xanthatina podría interactuar directamente con la proteína Keap1.

Introducción

Las proteínas son macromoléculas muy importantes en los organismos vivos y poseen una amplia gama de funciones únicas dentro de las células, como la composición de la membrana, la formación del citoesqueleto, la actividad enzimática, el transporte, la señalización celular y la participación en los mecanismos intracelulares y extracelulares 1,2,3. Las proteínas manifiestan sus funciones biológicas principalmente a través de interacciones específicas con una variedad de moléculas, incluidas otras proteínas, ácidos nucleicos, ligandos de moléculas pequeñas e iones metálicos 1,4. Los ligandos son pequeños compuestos moleculares que se unen específicamente a las proteínas de un organismo. La interacción entre proteínas y ligandos ocurre en sitios específicos de la proteína, llamados sitios de unión, también conocidos como bolsas de unión5. En la investigación en química medicinal, el enfoque radica en la identificación de proteínas clave que están claramente asociadas con enfermedades, que sirven como dianas para los medicamentos6. Por lo tanto, obtener una comprensión profunda de los sitios de unión entre proteínas y ligandos es de suma importancia para promover el descubrimiento, el diseño y la investigación de fármacos 7,8.

El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para estudiar la unión proteína-ligando, que emplea las estructuras tridimensionales de proteínas y ligandos para explorar sus principales modos de unión y afinidades al formar complejos estables 9,10,11. La aplicación de la tecnología de acoplamiento molecular se originó en la década de 1970. Sobre la base del principio de emparejamiento de cerradura y llave y utilizando los algoritmos del software de acoplamiento molecular, se puede determinar la interacción entre los compuestos y los objetivos moleculares mediante el análisis de los resultados del acoplamiento. Este enfoque permite la predicción de sitios de unión activos tanto para el compuesto como para la molécula objetivo. En consecuencia, facilita la identificación de una conformación de unión óptima (aquí denominada modelo de unión) para las interacciones ligando-receptor, lo cual es crucial para comprender la mecánica de estos compromisos moleculares 12,13,14,15. Si bien el acoplamiento molecular proporciona valiosas predicciones basadas en computadora de las interacciones ligando-receptor, es importante tener en cuenta que estos son hallazgos preliminares. En consecuencia, es esencial una verificación experimental adicional para confirmar estas interacciones.

El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), propuesto inicialmente por el equipo de investigación de Pär Nordlund en 2013, sirve como método para validar las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Esta técnica prueba específicamente la estabilidad térmica de las proteínas diana inducida por la unión a fármacos, proporcionando un enfoque práctico para confirmar las interacciones moleculares 16,17,18. Este enfoque se basa en el principio fundamental de que la unión de ligandos inicia un cambio térmico dentro de las proteínas objetivo y es aplicable a una amplia gama de muestras biológicas, incluidos lisados celulares, células vivas intactas y tejidos19,20. CETSA apoya el compromiso directo de pequeñas moléculas diana en células intactas mediante la detección de la estabilización termodinámica de las proteínas debido a la unión de ligandos y la vinculación de la respuesta fenotípica observada con el compuesto diana21,22. Entre las diversas metodologías derivadas de CETSA, el Western Blot-CETSA (WB-CETSA) se considera un enfoque clásico. Después de la preparación de la muestra mediante el método CETSA, se utiliza el análisis de Western blot para detectar alteraciones en la estabilidad térmica de la proteína objetivo. Esto permite determinar con precisión las interacciones fármaco-proteína dentro de los sistemas celulares17,23.

La xanthatina es un compuesto bioactivo aislado de la planta Xanthium L. con propiedades como antiinflamatoria, que se ha utilizado en la medicina tradicional china para tratar enfermedades como la sinusitis nasal y la artritis24,25. La proteína 1 asociada a la ECH similar a las algas kelch (Keap1) es un componente del complejo proteico multi-subunidad de ubiquitina ligasa Cullin-RING E3 basado en Cullin3 y un importante regulador de la homeostasis redox intracelular, que influye en la intensidad y duración de la respuesta inflamatoria mediante la modulación del estado redox intracelular26. En este estudio, primero utilizamos el acoplamiento molecular para investigar la interacción entre la xanthatina (molécula pequeña) y la proteína Keap1, con el objetivo de predecir su modo de unión. Posteriormente, empleamos el método CETSA para validar esta interacción evaluando el impacto de la xanthatina en la estabilidad térmica de la proteína Keap1.

Protocolo

1. Descargando las estructuras de xanthatin y Keap1

  1. Abra la base de datos de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), ingrese xanthatin (molécula pequeña), luego presione Buscar y haga clic en El primer resultado. Haga clic en Descargar y haga clic en Guardar en estructura 2D para guardar el compuesto en formato .sdf.
  2. Descarga la estructura cristalina de la proteína.
    1. Abra la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/), ingrese Keap1 y haga clic en Buscar. Haga clic en Humano debajo de organismos populares en la columna de la izquierda y, a continuación, haga clic en La primera entrada llamada Q14145 en la columna de la derecha.
    2. Haga clic en Estructura debajo de la función en la columna de la izquierda, busque la estructura con PDB ID: 2FLU y haga clic en RCSB-PDB. Haga clic en Descargar archivos y seleccione Formato PDB para descargar la estructura cristalina de la proteína Keap1.

2. Acoplamiento molecular

  1. Cree una nueva carpeta llamada acoplamiento molecular en el escritorio y guarde las estructuras de xanthatin (molécula pequeña) y Keap1 (proteína) descargadas en esta carpeta.
    NOTA: El nombre y la ruta de la carpeta deben estar en inglés.
  2. Abra el software Maestro, haga clic en Archivo, seleccione Cambiar directorio de trabajo, haga clic en Escritorio, haga doble clic para seleccionar la carpeta de acoplamiento molecular recién creada y haga clic en Elegir opciones.
  3. Procesamiento de moléculas pequeñas
    1. Haga clic en Opciones de archivo e importación de estructuras, haga clic en Escritorio, haga doble clic en la carpeta de acoplamiento molecular, haga clic en xanthatin Archivo de estructura y, a continuación, haga clic en Abrir para importar el archivo de molécula pequeña.
    2. Haga clic en Tareas en la esquina superior derecha del software y seleccione la opción LigPrep . Utilizar estructuras del espacio de trabajo; el resto de los parámetros son los parámetros predeterminados y haga clic en Ejecutar para realizar el procesamiento de moléculas pequeñas.
  4. Procesamiento de la estructura de las proteínas
    1. Haga clic en las opciones Archivo e Importar estructuras , haga clic en Escritorio y haga doble clic en la carpeta Acoplamiento molecular . Haga clic en el archivo de estructura de proteína Keap1 y, a continuación, haga clic en Abrir para importar el archivo de estructura de proteína.
    2. Haga clic en Tareas en la esquina superior derecha del software y seleccione la opción Asistente de preparación de proteínas . Marque la casilla Antes de eliminar aguas más allá de 5 Å de los grupos Het e ingrese un pH de 7.4+/-0.0. Haga clic en Preprocesar, haga clic en Refinar y, a continuación, haga clic en Optimizar > Eliminar aguas > minimizar.
    3. Haga clic en la siguiente tarea cuando se complete la tarea anterior. Haga clic en Tareas y seleccione la opción Mapa del sitio , use la configuración predeterminada para todos los parámetros y haga clic en Ejecutar.
    4. Haga clic en las opciones Archivo e Importar estructuras , haga clic en Escritorio, haga doble clic en la carpeta de acoplamiento molecular y abra la carpeta denominada sitemap_1. Haga clic en el primer archivo llamado Sitemap_1_out.maegz y, a continuación, haga clic en Abrir.
    5. Haga doble clic en el punto para seleccionar sitemap_1_protein en el espacio de trabajo y, a continuación, haga clic en Sitemap_1_site_1 para seleccionarlo . Haga clic en Tareas y seleccione la opción Generación de cuadrícula receptora .
      NOTA: Los sitios de proteínas predichos por el mapa del sitio se clasifican de acuerdo con la puntuación, con el sitio con la puntuación más alta en primer lugar.
    6. Seleccione la opción Entrada en receptor, con los parámetros restantes sin cambios. Haga clic en la pequeña bola blanca en la estructura de la proteína para generar una caja de acoplamiento de tamaño predeterminado y cambie el nombre del trabajo a deslizamiento-grid_2FLU. Haga clic en Ejecutar.
  5. Acoplamiento molecular
    1. Haga clic en Tareas y seleccione la opción Acoplamiento de ligandos . Seleccione la cuadrícula receptora As del archivo y haga clic en Examinar. Haga clic en Escritorio, haga doble clic en la carpeta de acoplamiento molecular, haga doble clic en el archivo de grid_2FLU deslizamiento, haga clic en Glide-grid_2FLU.zip archivo y, a continuación, haga clic en Abrir.
    2. Haga clic en Usar ligandos de archivos > examinar > escritorio. Haga doble clic en la carpeta de acoplamiento molecular, haga doble clic en el archivo ligprep_1, haga clic en Ligprep_1-out.maegz y, a continuación, haga clic en Abrir.
    3. Haga clic en Configuración y seleccione la opción Precisión como XP (precisión adicional), cambie el nombre del trabajo a deslizamiento dock_XP_2FLU y haga clic en Ejecutar.
  6. Ver los resultados del acoplamiento
    1. Haga clic en las opciones Archivo e Importar estructuras , haga clic en Escritorio y haga doble clic en la carpeta Acoplamiento molecular . Haga doble clic en el archivo de deslizamiento dock_XP_2FLU , haga clic en el archivo glide-dock_XP_1_pv.maegz y, a continuación, haga clic en Abrir.
    2. Haga doble clic en el punto para seleccionar el ligando en el espacio de trabajo y, a continuación, haga clic para seleccionar sitemap_1_protein. Haga clic en Tabla, desplácese hacia el extremo derecho y vea la puntuación en Puntuación de acoplamiento.
  7. Visualización de resultados 2D
    1. Haga doble clic en el punto para seleccionar el ligando en el espacio de trabajo y, a continuación, haga clic para seleccionar también sitemap_1_protein. Haga clic en Interacción de ligandos > Ver y marque la casilla de leyenda LID .
    2. Haga clic en Archivo, elija Guardar captura de pantalla, ingrese 6000 en el ancho, desmarque la casilla Fondo transparente y haga clic en Aceptar. Haga clic en Escritorio, asigne al archivo el nombre 2D-xanthatin-2FLU y guarde la imagen.
  8. Visualización de resultados 3D
    1. Haga doble clic en el punto para seleccionar el ligando en el espacio de trabajo y, a continuación, haga clic para seleccionar también sitemap_1_protein.
    2. Haga clic en L en Selección rápida para seleccionar moléculas pequeñas y, a continuación, haga clic en Estilo. Haga clic en la segunda línea en el estilo para cambiar el tamaño del enlace de la molécula pequeña y haga clic en los átomos de color para cambiar el color de la molécula pequeña.
    3. Seleccione la molécula pequeña de la figura, haga clic con el botón derecho del ratón, seleccione Expandir selección y elija 4 Å. Haga clic en Aplicar etiquetas con estilo para mostrar las etiquetas.
    4. Haga clic en la segunda línea del estilo para cambiar el tamaño de los enlaces de aminoácidos y haga clic en los átomos de color para cambiar el color de los aminoácidos.
    5. Haga clic en Siguiente > Invertir, mantenga presionada la tecla de control y haga clic en la posición del primer ojo en estilo para mostrar solo los aminoácidos con etiquetas.
    6. Haga clic en Estilo > cintas para mostrar la proteína como un estilo de cinta y haga clic en Editar cinta debajo de cintas para cambiar el color de la cinta.
    7. Haga clic en Interacciones en la esquina inferior derecha de la pantalla, haga clic con el botón derecho del ratón y desmarque contactos /conflictos.
    8. Busque medir en tareas, seleccione Distancia y haga clic en los dos átomos conectados por la línea punteada amarilla (enlace de hidrógeno) en la pantalla para medir las longitudes de los enlaces de hidrógeno.
    9. Mantenga presionada la rueda del mouse para rotar la proteína, ajustar la proteína al centro de la pantalla y asegurarse de que cada etiqueta de aminoácidos sea visible.
    10. Haga clic en Espacio de trabajo > Guardar imagen como y haga clic en el escritorio. Guarde la imagen como 600 ppp de forma predeterminada, asigne al archivo el nombre 3D-xanthatin-2FLU, elija el tipo de archivo como formato tiff y guarde la imagen.

3. Cultivo celular y preparación de muestras CETSA

  1. Cultivo celular
    1. Añadir 5 x 106 células RAW264,7/mL en una placa de cultivo de 100 mm e incubar con 6 mL de medio DMEM con 10% de FBS y 1% de solución antibiótica-antimicótica a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO2. Prepare tres platos y realice el experimento cuando las células alcancen el 80% de confluencia.
  2. Preparación de muestras CETSA
    1. Aspire el medio viejo, agregue 2 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) calentado a temperatura ambiente a cada plato y lave 2 veces.
    2. Agregue 2 mL de PBS a cada plato de células, mezcle las células y recoja las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 377 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 2 mL de PBS que contengan mezclas de inhibidores de proteasas de amplio espectro al 1%. Divida en tubos de microcentrífuga individuales con 1 mL de suspensión celular en cada uno.
    4. Congele los tubos de microcentrífuga en nitrógeno líquido hasta que estén sólidos blancos, luego descongele inmediatamente en un baño de agua a 37 ° C y repita 3 veces. Centrifugar a 12.000 x g a 4 °C durante 10 min.
    5. Tome dos tubos de microcentrífuga, uno con 100 μM de xanthatin y otro con un volumen igual de DMSO, y agregue 450 μL de sobrenadante centrifugado a cada tubo, incube a 37 °C durante 30 min.
    6. Añadir el sobrenadante de los dos tubos de microcentrífuga a 14 tubos de PCR a un volumen de 60 μL/tubo, y calentar los tubos simultáneamente a diferentes temperaturas (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C y 63 °C) durante 3 min, con dos tubos de PCR a cada temperatura, para los grupos DMSO y xanthatin, respectivamente.
    7. Para el grupo no calentado, tome sobrenadante de cada uno de los dos tubos de microcentrífuga y añádalo a 14 tubos de PCR, 7 para el grupo DMSO y 7 para el grupo xanthatin, en un volumen de 60 μL cada uno. No caliente las muestras aquí.
    8. Enfríe los tubos a temperatura ambiente para el grupo calentado. Centrifugar todos los tubos (calentados y no calentados) a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C y tomar 48 μL de sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 12 μL de tampón de carga de proteínas SDS-PAGE a cada tubo, vórtice para mezclar bien, y calentar en un baño de agua a 100 °C durante 5 min.
      NOTA: Las muestras CETSA preparadas deben almacenarse a -80 °C y analizarse mediante Western blot en el plazo de 1 semana.

4. Western blot

  1. Preparación del gel SDS-PAGE
    1. Enjuague un plato de vidrio largo y otro corto con agua ultrapura. Coloque las placas en la ranura de sujeción, luego en una tabla transparente. Agregue agua ultrapura y verifique las fugas durante 10 minutos.
    2. Añadir 8 mL de solución de gel inferior y 8 mL de tampón de gel inferior en un matraz cónico y mezclar agitando suavemente. Añadir 160 μL de promotor coagulante a la solución de gel y mezclar bien.
      NOTA: El volumen de la capa inferior de adhesivo no debe exceder la línea verde en la ranura de sujeción.
    3. Escurre el agua ultrapura de los platos y sécalos con papel de filtro. Agregue la solución de gel inferior preparada. Agregue 2 ml de alcohol isopropílico y espere 20 min para que se solidifique.
    4. Tome 2 mL de solución de gel superior y 2 mL de tampón de gel superior en un matraz cónico y mezcle agitando suavemente el matraz.
    5. Retire el alcohol isopropílico de la capa de gel y seque el exceso de alcohol isopropílico con papel de filtro.
    6. Agregue 40 μL de promotor de coagulante a la solución de gel superior mezclada, mezcle bien, luego agregue entre las placas de vidrio largas y cortas e inserte un peine de 1,5 mm y 15 orificios, espere 20 min.
      NOTA: El peine debe insertarse perpendicular a la capa superior, sin burbujas de aire entre el peine y la solución.
  2. Electroforesis
    1. Añadir 1 litro de agua ultrapura a un vaso de precipitados, añadir un sobre de polvo tampón SDS-PAGE, agitar bien con una varilla de vidrio y añadir el gel preparado a la unidad de electroforesis. Coloque la unidad en la caja y saque el peine.
    2. Descongele el marcador y las muestras CETSA a temperatura ambiente, en vórtice y gire hacia abajo. Añadir 2,5 μL de marcador al primer pocillo y 20 μL de muestras de CETSA a cada uno de los pocillos restantes según la secuencia predeterminada.
      NOTA: Las muestras de CETSA se añadieron sucesivamente de acuerdo con el tratamiento de temperatura descrito en el paso 3.2.6 de 45 °C a 63 °C; primero se agregó el grupo DMSO, luego el grupo xanthatin (Figura 1).
    3. Agregue la solución de electroforesis restante a la unidad de electroforesis, cierre la tapa e inserte el electrodo, de polo positivo a polo positivo, de polo negativo a polo negativo.
    4. Encienda el interruptor de encendido y ajuste el interruptor de voltaje a 80 V para iniciar la electroforesis.
  3. Transferencia a membrana
    1. Agregue 850 mL de agua ultrapura, 100 mL de etanol anhidro y 50 mL de tampón de transferencia rápida a un vaso de precipitados y revuelva bien. Prepare tableros de espuma, cuchillos de plástico, pinzas, bandejas y dispositivos de transferencia de membranas.
    2. Corta la membrana de PVDF según el tamaño del gel, márcala y sumérgela en metanol durante 30 s para activarla.
    3. Vierta la solución de transferencia en la bandeja, coloque y abra las pinzas de transferencia, y coloque una almohadilla de esponja y tres capas de papel de filtro de transferencia.
    4. Detenga la electroforesis y luego abra la tapa de la caja de electroforesis. Tome el dispositivo de electroforesis, vierta la solución de electroforesis y retire la placa. Coloque la placa en la tabla de espuma, sáquela suavemente con un cuchillo de plástico y corte el gel para visualizar claramente el marcador de proteínas y las proteínas objetivo.
    5. Sujeta un lado del rotulador con unas pinzas, lávalo en una bandeja que contenga la solución transmembrana y colócalo sobre papel de filtro. Sumerja la membrana de PVDF activado en la solución de transferencia, sostenga el lado etiquetado con pinzas y cubra el gel boca abajo.
      NOTA: El lado marcado de la membrana de PVDF es la parte frontal y preste atención al hecho de que no se generan burbujas durante el proceso de colocación.
    6. Coloque dos capas de papel de filtro de transferencia y una capa de almohadilla de esponja sobre la membrana de PVDF, cubra y sujete los clips de transferencia y colóquelos en el tanque de transferencia.
      NOTA: Color negro del clip de transferencia a color negro de la ranura de transferencia.
    7. Agregue la solución transmembrana restante al casete transmembrana, cúbrala con la tapa, positivo a positivo, negativo a negativo.
    8. Ajuste la corriente a 400 mA, el tiempo a 30 min, y luego presione Run para comenzar a transferir la membrana a temperatura ambiente.
  4. Bloqueante
    1. Agregue 2 L de agua ultrapura a un vial de vidrio, agregue un sobre de polvo TBS y luego agregue 2 mL de Tween para hacer la solución de TBST. Pese el polvo de BSA para preparar una solución de BSA al 5% con TBST y agregue 6 ml de solución de BSA a la caja de incubación.
    2. Detenga la transferencia de membrana y luego abra el clip de transferencia. Sujete el lado marcador de la membrana de PVDF y colóquelo en la caja de incubación. Coloque la caja de incubación en un agitador y bloquee durante 1,5 h a temperatura ambiente.
  5. Incubación del anticuerpo primario
    1. Prepare el anticuerpo primario (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) con una solución de BSA al 5% a 1:1000, recicle la solución de BSA en la caja de la incubadora y agregue 6 ml de anticuerpo primario a la caja de incubación. Coloque la caja de incubación en una caja de espuma con bolsas de hielo y manténgala en una coctelera durante la noche.
  6. Incubación de anticuerpos secundarios
    1. Recoja el anticuerpo primario en la caja de incubación al día siguiente, luego agregue 6 ml de solución de TBST y colóquela en un agitador para lavar durante 5 minutos.
    2. Vierta la solución TBST lavada y agregue fresca para lavar; repita 5 veces y prepare el anticuerpo secundario con una solución de BSA al 5% a 1:5000.
    3. Vierta la solución de TBST y agregue 6 mL de anticuerpo secundario a la caja de incubación. Coloque la caja de incubación en un agitador e incube durante 1,5 h a temperatura ambiente.
    4. Recoja el anticuerpo secundario (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), luego agregue 6 ml de solución de TBST y colóquela en un agitador para lavar durante 5 minutos. Vierta la solución TBST lavada y agregue fresca para lavar; Repita 5 veces.
  7. Exposición de las tiras
    1. Conserve la solución TBST al final del último lavado. Tome volúmenes iguales de los reactivos quimioluminiscentes A y B, agite y mezcle bien. Protege la solución de la luz.
    2. Abra el sistema de imágenes de gel, haga clic en Muestras, verifique la calibración, espere a que se complete la calibración y luego haga clic en Marcador, verifique la calibración.
    3. Tome el lado marcador de la tira con pinzas y sumérjalo completamente en la solución reactiva quimioluminiscente. Sujete un lado del marcador para colocar la tira boca abajo en el generador de imágenes, cierre la tapa del generador de imágenes, haga clic en Exposición y ajuste el tiempo de exposición a 1 s.
      NOTA: El desarrollador debe cubrir completamente la tira, y el desarrollo debe estar en un entorno oscuro.
    4. Haga clic en Guardar, asigne un nombre a la imagen y guárdela como un archivo .tif. Analice la densidad óptica de la Western blot. Los valores de gris de cada temperatura en el grupo DMSO se compararon con los valores de gris de 45 °C, y los valores de gris de cada temperatura en el grupo de xanthatin se compararon con los valores de gris de xanthatin a 45 °C.

Resultados

El análisis de acoplamiento molecular predijo la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1. La Figura 2 muestra la formación de enlaces de hidrógeno entre la xanthatina y los residuos de aminoácidos Gly-367 y Val-606 de la proteína Keap1, con una longitud de enlace de hidrógeno de 2,17 Å para Gly-367 y 2,13 Å para Val-606. Además, la puntuación de acoplamiento calculada de -5,69 kcal/mol significa una buena afinidad de unión entre la xanthatina y la proteína Keap1.

Discusión

La identificación de dianas patológicas y el descubrimiento y desarrollo de fármacos están estrechamente interrelacionados27. Al dirigirse con precisión a objetivos específicos, se pueden desarrollar candidatos a fármacos para tratar enfermedades particulares de manera más eficaz y, al mismo tiempo, minimizar los efectos secundarios asociados con los medicamentos28,29. Las dianas más utilizadas son las dianas proteicas

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82004031) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022NSFSC1303). Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun, del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por su ayuda con la mancha occidental.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membraneMilliporePR05509
Anhydrous ethanolChron chemicals64-17-5
Bovine serum albuminBioFroxx4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixturesBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Enhanced chemiluminescence reagentBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH antibodyProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Gel Imaging InstrumentE-BLOTTouch Imager Pro
Gradient PCR instrumentBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifugeBeckman CoulterAllegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibodyProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Isopropyl alcohol Chron chemicals67-63-0
Keap1 antibodyZen BioScience Co., LtdR26935
Metal bathAnalytik JenaTSC
MethanolChron chemicals67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Phosphate buffer salineBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Prestained Color Protein MarkerBiosharp BL741A
Protein Blotting Electrophoresis SystemBio-RadMiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cellBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 cell-specific mediumProcell Life Science&Technology Co., LtdCM-0597
SDS-PAGE protein loading bufferBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018
Tris buffered saline powderServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Water bathMemmertWNE10
Water purifierMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706

Referencias

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