Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تطوير طريقة لتصور تسرب الصبغة بسبب انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) عن طريق إعطاء صبغتين فلوريتين للفئران في نقاط زمنية مختلفة. سهل استخدام الجلسرين كمادة حاصلة بالتبريد الكيمياء المناعية على نفس العينة.

Abstract

تستخدم الأصباغ الفلورية لتحديد مدى تسرب الصبغة الذي يحدث بسبب انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB). يعد وضع العلامات بهذه الأصباغ عملية معقدة تتأثر بعدة عوامل ، مثل تركيز الأصباغ في الدم ، ونفاذية أوعية الدماغ ، ومدة تسرب الصبغة ، وانخفاض تركيز الصبغة في الأنسجة بسبب التحلل والانتشار. في نموذج إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ، يؤدي التعرض لموجات الصدمة الناجمة عن الانفجار (BSWs) إلى انهيار BBB خلال فترة زمنية محدودة. لتحديد التسلسل الدقيق لانهيار BBB ، تم حقن إيفانز الأزرق والفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران داخل الأوعية الدموية وداخل القلب في الفئران في نقاط زمنية مختلفة بالنسبة للتعرض ل BSW. ثم تم تسجيل توزيع مضان الصبغة في شرائح الدماغ. كشفت الاختلافات في التوزيع والشدة بين الصبغتين عن التسلسل الزماني المكاني لانهيار BBB. أظهر التلوين المناعي لشرائح الدماغ أن الاستجابات النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة مرتبطة بمواقع انهيار BBB. يتمتع هذا البروتوكول بإمكانيات واسعة للتطبيق في الدراسات التي تتضمن نماذج مختلفة لتقسيم BBB.

Introduction

يحدث انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) والخلل الوظيفي بسبب الالتهاب الجهازي والالتهابات وأمراض المناعة الذاتية والإصابات والأمراض التنكسيةالعصبية 1. في إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) الناتجة عن التعرض لموجات الصدمة الناجمة عن الانفجار (BSWs) ، لوحظ وجود علاقة كبيرة بين شدة BSWs وكمية تسرب صبغة الفلورسنت بسبب انهيار BBB2،3،4. تتمثل إحدى السمات البارزة لانهيار BBB في mTBI في أنه يبدأ على الفور أو في غضون ساعات قليلة بعد التعرض ل BSW وعادة ما تكون عملية عابرة تستمر لمدة أسبوع تقريبا قبل ظهور اضطرابات عصبية مزمنة متأخرة3،5،6،7. على الرغم من أن التفاصيل لا تزال غير واضحة ، إلا أن انهيار BBB هو جزء من سلسلة مرضية طويلة الأمد وقد يكون أيضا عاملا تنبؤيا في mTBI6. لذلك ، من المهم فهم التوزيعات المكانية والزمانية لانهيار BBB في الدماغ.

تستخدم الأصباغ الفلورية لتحديد مدى انهيار BBB 3,8. نظرا لأن تركيز الأصباغ في الدم وحجم ومدى انهيار BBB يتغير بمرور الوقت ، يلزم توخي الحذر عند تفسير صور تسرب الصبغة. على سبيل المثال ، لا يشير عدم وجود تسرب الصبغة بالضرورة إلى عدم وجود انهيار BBB. قد لا يتم الكشف عن انهيار BBB قبل أو بعد زيادة تركيز الصبغة في الدم. حتى لو تراكمت الصبغة بنجاح حيث حدث انهيار BBB ، فقد تكون قد فقدت بمرور الوقت بعد توقف الانهيار. بشكل عام ، تفرز المواد القابلة للذوبان في الماء والخاملة بيولوجيا بسرعة في البول9. لذلك ، لتحديد ما إذا كان انهيار BBB يحدث في وقت محدد ، يتم الحصول على النتائج الأكثر موثوقية عندما يتم إعطاء صبغة فلورية في مجرى الدم لفترة قصيرة مباشرة قبل تثبيت. يجب استخدام الفلورسينات إيزوثيوسيانات (FITC) - ديكستران المتاح تجاريا بوزن جزيئي محدد بهذه الطريقة.

إيفانز الأزرق هو صبغة آزو زرقاء معترف بها على نطاق واسع مع تقارب قوي مع ألبومين المصل. تظهر الصبغة مضان أحمر عندما تثيرها الضوء الأخضر في الأنظمةالبيولوجية 2. نظرا لطبيعته الخاملة ، يظل مركب ألبومين مصل إيفانز الأزرق في الدم لمدة تصل إلى ساعتين ، مما يجعله متتبعا مفيدا بقدرة 69 كيلو دالتون لوضع العلامات على المناطق ذات BBB المخترق لهذه المدةعلى الأقل 10،11. لذلك ، من المهم مراعاة أوجه عدم اليقين المحتملة المحيطة بالحركية الدوائية وسمية Evans blue9. ومع ذلك ، أظهرت دراسة حديثة أن إيفانز الأزرق يستمر في التراكم في المناطق التي يكون فيها BBB غائبا أو معطلا7. مكنت هذه الميزة Evans Blue من تسجيل تاريخ انهيار BBB ، بينما تم استخدام FITC-dextran لتسجيل انهيار BBB في نقطة زمنية محددة بعد تعرض BSW. على الرغم من أنه يمكن إعطاء إيفانز الأزرق عن طريق الوريد أو داخل الصفاق10 ، إلا أنه يفضل تناوله عن طريق الوريد للتجارب الحساسة للوقت. تهدف هذه الدراسة إلى إثبات استخدام إيفانز الأزرق و FITC-dextern للكشف عن التوزيع الزماني المكاني لانهيار BBB بعد التعرض ل BSW.

ثانيا ، قدمت الدراسة تقنية لتجميد شرائح الدماغ بعد ملاحظة تألق انهيار BBB وإعداد شرائح أرق مناسبة للإجراءات الكيميائية المناعية. يعمل استخدام الجلسرين كوسيط تركيب ومحلول تجميد على تبسيط عملية الكيمياء المناعية. من خلال مقارنة صور انهيار BBB مع تلك الموجودة في الكيمياء المناعية ، يمكن ربط التوزيع الزماني المكاني لانهيار BBB باستجابة الأنسجة لنفس العينة.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للتجارب على التي وضعتها كلية طب الدفاع الوطني (توكوروزاوا ، اليابان). تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة البحوث الحيوانية في كلية طب الدفاع الوطني (الموافقة رقم 23011-1). تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع ووزنهم 19-23 جم في هذه الدراسة. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم إجراء حقنة إيفانز الزرقاء الواحدة وتروية FITC-dextrann في نقاط زمنية مختلفة فيما يتعلق بالتعرض الفردي ل BSW. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التخدير

ملاحظة: هذا بروتوكول معدل يزيد من كمية الميديتوميدين بمقدار 2.5 مرة مقارنة بالبروتوكول الأصلي12. كانت جرعات ميديتوميدين هيدروكلوريد وميدازولام وبوتورفانول 0.75 مجم / كجم و 4 مجم / كجم و 5 مجم / كجم على التوالي.

  1. تحضير خليط من هيدروكلوريد ميديتوميدين (75 ميكروغرام / مل) وميدازولام (400 ميكروغرام / مل) وبوتورفانول (500 ميكروغرام / مل) في محلول ملحي فسيولوجي.
  2. يتم تطبيق الخليط داخل الصفاق لتخدير الفأر (10 ميكرولتر / جم)13.
  3. بعد حوالي 5-10 دقائق ، تحقق من التخدير الكافي من خلال ملاحظة عدم وجود قرص الذيل وردود أفعال سحب الدواسة.
  4. حافظ على دفء الماوس حتى يتعافى من آثار التخدير.

2. التعرض BSW

ملاحظة: تم استخدام أنبوب صدمة داخلي في هذه الدراسة14.

  1. قم بتخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.
  2. ضع الماوس على بعد 5 سم من طرف مخرج أنبوب الصدمة ، وتأكد من أن محور جسمه مواز لمحور الأنبوب ولكن لا يتماشى معه.
  3. قم بتوصيل تعريض BSW واحد مع ذروة ضغط زائد تبلغ 25 كيلو باسكال على الرأس.
    ملاحظة: حافظ على دفء الماوس حتى يتعافى من آثار التخدير. راقب بانتظام حالة الماوس المعالج. إذا لوحظت علامات الضيق ، مثل صعوبة الرضاعة أو الشرب أو الانحناء أو المظهر غير الطبيعي لفترات طويلة دون علامات التعافي ، فقم بالقتل الرحيم للفأر وإنهاء التجربة مبكرا. تجنب إعطاء المسكنات، لأنها قد تؤثر على الاستجابة الدبقية.

3. حقن إيفانز الأزرق في وريد الذيل

ملاحظة: يجب إعطاء محلول إيفانز الأزرق عن طريق الوريد دون تخدير. في حالة وجود التخدير ، غالبا ما لا تخترق الصبغة الجسم بشكل كاف ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى انخفاض ضغط الدم ودرجة حرارةالجسم 13. تم إعطاء إيفانز الأزرق بجرعة 100 مجم / كجم.

  1. تحضير محلول إيفانز الأزرق (4٪ وزن / حجم في محلول ملحي) في أنبوب دقيق ، ثم دوامة وتخزينه في الظلام قبل الاستخدام.
  2. حقن المحلول في الوريد الذيل (2.5 ميكرولتر / جم)13.

4. نضح عبر القلب مع محلول FITC-dextran والتثبيت

  1. أضف الهيبارين إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحصول على تركيز 1 U / مل ، ثم أضف FITC-dextran إلى PBS الهيباريني لتحقيق تركيز 3 مجم / مل.
  2. قم بإذابة مسحوق FITC-dextaren تماما قبل الاستخدام. للقيام بذلك ، رج المحلول برفق لمدة 30 دقيقة أو أكثر. قبل الاستخدام ، تحقق بعناية من وجود أي مسحوق FITC-dextern غير مذاب. إذا بقي أي منها ، استمر في الرج حتى يذوب تماما.
  3. قم بتخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.
  4. تابع بروتوكول تثبيت التروية القياسي باستخدام مضخة تمعجية15،16. أولا ، النفخ مع PBS الهيبارين المحتوي على FITC-dextran لمدة دقيقتين بمعدل 4.0 مل / دقيقة. ثم قم بتفريغ محلول عازلة محايد من الفورمالين بنسبة 10٪ أو 4٪ بارافورمالدهايد - PBS لمدة دقيقتين بمعدل 4.0 مل / دقيقة ، متبوعا ب 8 دقائق بمعدل 3.5 مل / دقيقة.
  5. قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام المقص الجراحي والملاقط15،16. بعد التشريح ، قم بإصلاح الدماغ بعد ذلك طوال الليل في نفس المثبت (أي 10٪ محلول عازلة محايد من الفورمالين أو 4٪ بارافورمالدهايد PBS) عند 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي ، استبدل المثبت ب PBS.

5. معالجة أنسجة المخ

ملاحظة: حتى إذا اكتمل تثبيت التروية ، فقد يتشتت Evans blue و FITC-dextran في المخزن المؤقت. لذلك ، يجب إكمال الإجراءات المؤدية إلى الخطوة 6.8 في غضون أسبوع بعد تثبيت التروية. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب تعريض العينة للضوء.

  1. قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من 20٪ من الجلسرين في مخزن الفوسفات (PB ؛ الرقم الهيدروجيني 7.4) في كل بئر.
  2. باستخدام قطاعة الدماغ ، قم بتقطيع الدماغ إلى 12 شريحة ، كل منها بسمك 1 مم.
  3. انقل كل شريحة إلى البئر المقابل للوحة 24 بئرا واحفظها على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
  4. استبدل المحلول بنسبة 50٪ من الجلسرين-PB وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
  5. أخيرا ، استبدل المحلول بالجلسرين بنسبة 100٪. للمراقبة المجهرية الفورية ، اترك الشرائح تقف لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية. ستكون الشرائح الآن شفافة وجاهزة للمراقبة المجهرية.

6. قياس التألق لتسرب الصبغة

ملاحظة: تختلف كفاءة وضع العلامات الفلورية من ماوس إلى آخر. لذلك ، يجب تطبيع شدة الفلورة. يتم التعبير عن قيم التألق بالنسبة لتلك الموجودة داخل النواة الشبكية العملاقة (GRN) لأن هذه المنطقة تتأثر بشكل ضئيل بعلاج BSW.

  1. أضف 500 ميكرولتر من الجلسرين إلى قاع طبق زجاجي مقاس 35 مم.
  2. انقل الشريحة إلى محلول الجلسرين وقم بتغطية سطحها بغطاء زجاجي.
  3. قم بإزالة الجلسرين الزائد من حافة الغطاء.
  4. قم بقياس شدة التألق للشريحة تحت المجهر الفلوري.
  5. بعد القياس المجهري ، أعد الشريحة إلى البئر.
  6. كرر القياس لجميع الشرائح ال 12.
  7. أضف 500 ميكرولتر من PB إلى كل بئر وقم بتخزين اللوحة المكونة من 24 بئرا عند 4 درجات مئوية طوال الليل ؛ في اليوم التالي ، ستكون الشرائح مشبعة بنسبة 50٪ من الجلسرين-PB.
  8. استبدل المحلول بنسبة 30٪ من الجلسرين PB وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
  9. قم بتنفيذ الإجراءات الواردة في الخطوة 7 في غضون أسابيع قليلة.

7. التشريح بالتبريد والكيمياء المناعية

  1. قم بإعداد طبق مكون من 24 بئرا عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من خليط بكميات متساوية من وسط تجميد الأنسجة و 30٪ جلسرين PB إلى البئر 1. ثم أضف 1000 ميكرولتر من وسط تجميد الأنسجة إلى البئر 2.
  2. انقل الشريحة إلى بئر 1 ورج الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. انقل الشريحة إلى بئر 2 ورج الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. قم بتجميد الشريحة بسرعة باستخدام الأيزوبنتان باستخدام الثلج الجاف ، مع الحرص على عدم ثني الشريحة. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية حتى التقطيع بالتبريد.
  5. قم بتقطيع الشريحة بالتبريد بسمك 6 ميكرومتر. بعد التجفيف على شريحة المجهر ، قم بتخزين الأقسام عند -80 درجة مئوية.
  6. لاسترجاع المستضد17 ، اغمر الأقسام في سترات الصوديوم 10 ملي مولار (درجة الحموضة 6.0) ، وقم بالتسخين إلى 100 درجة مئوية مرة واحدة ، ثم حافظ على 98 درجة مئوية لمدة ساعة.
  7. اغسل الأقسام على نطاق واسع بالماء المقطر. الأقسام جاهزة الآن للتلوين الكيميائي المناعي.

النتائج

يوضح الشكل 1 أ المسار الزمني لحقن الصبغة فيما يتعلق ببداية BSW ، مع ذروة ضغط زائد تبلغ 25 كيلو باسكال. في بروتوكول "Post" ، تم إعطاء محلول إيفانز الأزرق داخل الأوعية الدموية قبل ساعتين من تروية FITC-dextran ، والتي تم إجراؤها بعد 6 ساعات ، و 1 يوم ، و 3 أيام ، و 7 أيام بعد ?...

Discussion

تم استخدام تقنية جديدة للوضع المزدوج باستخدام إيفانز الأزرق و FITC-dextern لتصور التوزيع المكاني الزمني الدقيق لانهيار BBB في دماغ واحد بدقة. في نموذج BSW منخفض الكثافة ، لوحظت اختلافات ملحوظة في مدى وموقع ودرجة تسرب الصبغة في الأدمغة التي تم فحصها (الشكل 2

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر Mayumi Watanabe على تقنية التقطيع بالتبريد. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث متقدمة في الطب العسكري من وزارة الدفاع اليابانية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Formalin Neutral Buffer SolutionFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, RabbitDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, RabbitFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351tissue freezing medium
DomitorOrion Corporationmedetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/CaseCORNING351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)AGC TECHNO GLASS3910-03535 mm glass bottom dish
IX83 Inverted MicroscopeOLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope SlidesMatsunami GlassMAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mmMatsunami GlassC018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Peristaltic PumpATTOSJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX
Adult Mouse, 30 g, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000Cbrain slicer
VetorphaleMeiji Animal HealthVETLI5butorphanol

References

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971 (2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681 (2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232 (2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385 (2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595 (2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771 (2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564 (2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807 (2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved