경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

요약

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

초록

형광 염료는 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인해 발생하는 염료 유출의 정도를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 염료를 사용한 라벨링은 혈액 내 염료의 농도, 뇌 혈관의 투과성, 염료 유출 기간, 분해 및 확산으로 인한 조직의 염료 농도 감소와 같은 여러 요인의 영향을 받는 복잡한 과정입니다. 경미한 외상성 뇌 손상 모델에서 폭발 유도 충격파(BSW)에 노출되면 제한된 시간 내에 BBB 파괴가 유발됩니다. BBB 분해의 정확한 순서를 결정하기 위해 Evans blue 및 fluorescein isothiocyanate-dextran을 BSW 노출과 관련된 다양한 시점에서 마우스에 혈관 내 및 심내 주사했습니다. 그런 다음 뇌 절편에서 염료 형광의 분포를 기록했습니다. 두 염료 사이의 분포와 강도의 차이는 BBB 파괴의 시공간 순서를 밝혔습니다. 뇌 절편의 면역 염색은 성상세포 및 미세아교세포 반응이 BBB 파괴 부위와 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 다양한 BBB 분해 모델과 관련된 연구에 적용할 수 있는 광범위한 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

혈액뇌장벽(BBB) 파괴 및 기능 장애는 전신 염증, 감염, 자가면역 질환, 부상 및 신경 퇴행성 질환으로 인해 발생합니다¹. 폭발 유도 충격파(BSW)에 대한 노출로 인한 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)에서 BSW의 강도와 BBB 파괴로 인한 형광 염료 누출 양 사이에 상당한 상관관계가 관찰되었습니다 ^2,3,4. mTBI에서 BBB 분해의 한 가지 주목할 만한 특징은 BSW에 노출된 직후 또는 몇 시간 이내에 시작되며, 일반적으로 지연된 만성 신경 질환이 나타나기 전에 약 일주일 동안 지속되는 일시적인 과정이라는 것입니다 3,5,6,7. 세부 사항은 불분명하지만, BBB 파괴는 오래 지속되는 병리학적 연쇄 반응의 일부이며 mTBI⁶의 예후 인자로 작용할 수도 있습니다. 따라서 뇌에서 BBB 분해의 공간적, 시간적 분포를 이해하는 것이 중요합니다.

BBB 파괴 정도를 측정하기 위해 형광 염료가 사용됩니다 ^3,8. 염료의 혈중 농도와 BBB 분해의 크기 및 정도는 시간이 지남에 따라 변하기 때문에 염료 유출 이미지를 해석할 때 주의가 필요합니다. 예를 들어, 염료 유출이 없다고 해서 반드시 BBB 파괴가 없음을 나타내는 것은 아닙니다. 염료의 혈중 농도가 증가하기 전이나 후에 BBB 분해가 감지되지 않을 수 있습니다. BBB 분해가 발생한 곳에서 염료가 성공적으로 축적되었다 하더라도 분해가 중단된 후 시간이 지남에 따라 손실되었을 수 있습니다. 일반적으로 수용성 및 생물학적으로 불활성인 물질은 소변을 통해 빠르게 배설된다⁹. 따라서 BBB 분해가 특정 시간에 발생하는지 여부를 확인하기 위해 동물을 고정하기 직전 짧은 기간 동안 형광 염료를 혈류에 투여할 때 가장 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 시판되는 특정 분자량을 가진 시판되는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란을 이러한 방식으로 사용해야 합니다.

Evans blue는 혈청 알부민에 대한 친화력이 강한 널리 알려진 파란색 아조 염료입니다. 염료는 생물학적 시스템에서 녹색 빛에 의해 여기될 때 적색 형광을 나타냅니다². 불활성 특성으로 인해 Evans 블루 세럼 알부민 복합체는 최대 2시간 동안 혈액에 남아 있어 적어도 이 기간 동안 손상된 BBB가 있는 영역을 표지하는 데 유용한 69kDa 추적자가 됩니다^10,11. 따라서 Evans blue⁹의 약동학 및 독성을 둘러싼 잠재적인 불확실성을 고려하는 것이 중요합니다. 그러나 최근 연구에 따르면 에반스 블루는 BBB가 없거나 방해받은 영역에서 계속 축적되는 것으로 나타났습니다⁷. 이 기능을 통해 Evans Blue는 BBB 붕괴 이력을 기록할 수 있었고, FITC-dextran은 BSW 노출 후 특정 시점의 BBB 붕괴를 기록하는 데 사용되었습니다. Evans blue는 정맥 투여 또는 복강 내 투여가 가능하지만¹⁰, 시간에 민감한 실험에는 정맥 투여가 선호됩니다. 이 연구는 BSW 노출 후 BBB 파괴의 시공간 분포를 감지하기 위해 Evans blue와 FITC-dextran을 사용하는 것을 입증하는 것을 목표로 했습니다.

둘째, 본 연구는 BBB 분해의 형광을 관찰한 후 뇌 절편을 동결하고 면역조직화학 시술에 적합한 더 얇은 절편을 준비하는 기술을 제시했다. 글리세롤을 장착 매체 및 동결 보호제로 사용하면 면역조직화학 과정이 단순화됩니다. BBB 분해 이미지를 면역조직화학의 이미지와 비교함으로써 BBB 분해의 시공간 분포를 동일한 샘플의 조직 반응과 상관시킬 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 국방의과대학(일본 도코로자와)에서 제정한 동물실험 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구 프로토콜은 국방의과대학 동물연구위원회(Committee for Animal Research)의 승인을 받았다(승인번호 23011-1). 이 연구에는 8주령, 체중 19-23g의 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 단일 Evans 블루 주입 및 FITC-덱스트란 관류는 단일 BSW 노출과 관련하여 다양한 시점에서 수행되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마취

참고: 이것은 원래¹²에 비해 메데토미딘의 양을 2.5배 증가시키는 수정된 프로토콜입니다. 메데토미딘 염산염, 미다졸람, 부토르파놀의 투여량은 각각 0.75mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg이었다.

1. 메데토미딘 염산염(75μg/mL), 미다졸람(400μg/mL) 및 부토르파놀(500μg/mL)의 혼합물을 생리식염수에 준비합니다.
2. 혼합물을 복강내로 투여하여 마우스(10μL/g)를 마취합니다^.13.
3. 약 5-10분 후, 꼬리 꼬집음 및 페달 철수 반사가 없는지 관찰하여 충분한 마취를 확인합니다.
4. 마취 효과에서 회복될 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.

2. BSW 노출

참고: 이 연구에서는 사내 충격관이 사용되었다¹⁴.

1. 1단계에서 설명한 대로 마우스를 마취합니다.
2. 마우스를 쇼크 튜브의 출구 끝에서 5cm 떨어진 곳에 배치하고 본체 축이 튜브의 축과 평행하지만 정렬되지 않도록 합니다.
3. 머리에 25kPa의 최대 과압으로 단일 BSW 노출을 제공합니다.
   알림: 마취 효과에서 회복될 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하십시오. 치료된 마우스의 상태를 정기적으로 모니터링하십시오. 섭식 또는 음주 곤란, 구부정 또는 회복의 징후 없이 장기간 비정상적인 모습과 같은 고통의 징후가 관찰되면 마우스를 안락사시키고 실험을 조기에 종료합니다. 진통제는 잠재적으로 신경교 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 복용을 피하십시오.

3. 꼬리 정맥에 Evans 파란색 주입

참고: Evans 블루 용액은 마취 없이 정맥 주사해야 합니다. 마취가 있는 상태에서 염료가 신체에 충분히 침투하지 못하는 경우가 많은데, 이는 혈압과 체온 저하로 인한 것으로 보인다¹³. 에반스 블루는 100 mg/kg의 용량으로 투여되었다.

1. 마이크로튜브에 Evans 블루 용액(식염수 4% w/v)을 준비한 다음 소용돌이치고 사용하기 전에 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 용액을 꼬리 정맥(2.5μL/g)에 주입합니다^.13.

4. FITC-dextran 용액 및 고정을 사용한 경심 관류

1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 헤파린을 첨가하여 1 U/mL의 농도를 얻은 다음 헤파린 처리된 PBS에 FITC-덱스트란을 첨가하여 3 mg/mL의 농도를 얻습니다.
2. 사용하기 전에 FITC-dextran 분말을 완전히 녹입니다. 이렇게하려면 용액을 30 분 이상 부드럽게 흔듭니다. 사용하기 전에 용해되지 않은 FITC-덱스트란 분말이 있는지 주의 깊게 확인하십시오. 남아 있으면 완전히 녹을 때까지 계속 흔듭니다.
3. 1단계에서 설명한 대로 마우스를 마취합니다.
4. 연동 펌프^15,16을 사용하여 표준 관류 고정 프로토콜을 진행합니다. 먼저 FITC-dextran을 함유한 헤파린 처리된 PBS를 4.0mL/분의 속도로 2분 동안 관류합니다. 그런 다음 10% 포르말린 중성 완충액 용액 또는 4% 파라포름알데히드-PBS를 4.0mL/분의 속도로 2분 동안 관류한 다음 3.5mL/분의 속도로 8분 동안 관류합니다.
5. 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거한다 ^15,16. 해부 후 4°C에서 동일한 고정액(즉, 10% 포르말린 중성 완충 용액 또는 4% 파라포름알데히드-PBS)에 하룻밤 동안 뇌를 고정합니다.
6. 다음 날에는 정착액을 PBS로 교체하십시오.

5. 뇌 조직 처리

참고: 관류 고정이 완료되더라도 Evans blue 및 FITC-dextran은 완충액으로 분산될 수 있습니다. 따라서 6.8단계까지 이어지는 절차는 관류 고정 후 일주일 이내에 완료해야 합니다. 또한 샘플을 빛에 노출시키지 마십시오.

1. 각 웰의 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에 20% 글리세롤 500μL가 포함된 24웰 플레이트를 준비합니다.
2. 뇌 슬라이서를 사용하여 뇌를 각각 1mm 두께의 12개 조각으로 자릅니다.
3. 각 슬라이스를 24웰 플레이트의 해당 웰로 옮기고 4°C에서 최소 2시간 동안 보관합니다.
4. 용액을 50% 글리세롤-PB로 교체하고 4°C에서 최소 2시간 동안 보관합니다.
5. 마지막으로 용액을 100% 글리세롤로 교체합니다. 즉각적인 현미경 관찰을 위해 슬라이스를 실온에서 최소 2시간 동안 방치하거나 4°C에서 보관하십시오. 이제 조각이 반투명하여 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

6. 염료 유출의 형광 측정

참고: 형광 라벨링 효율은 마우스마다 다릅니다. 따라서 형광 강도를 정규화해야 합니다. 형광 값은 거대세포 망상핵(GRN) 내의 값에 비해 상대적으로 표현되는데, 이 영역은 BSW 처리의 영향을 최소화하기 때문입니다.

1. 35mm 유리 바닥 접시 바닥에 글리세롤 500μL를 추가합니다.
2. 슬라이스를 글리세롤 용액에 옮기고 표면을 커버 유리로 덮습니다.
3. 커버 글라스 가장자리에서 과도한 글리세롤을 제거합니다.
4. 형광 현미경으로 슬라이스의 형광 강도를 측정합니다.
5. 현미경 측정 후 슬라이스를 우물로 되돌립니다.
6. 12개 슬라이스 모두에 대해 측정을 반복합니다.
7. 각 웰에 500μL의 PB를 추가하고 24웰 플레이트를 4°C에서 밤새 보관합니다. 다음 날, 슬라이스는 50% 글리세롤-PB로 포화됩니다.
8. 용액을 30% 글리세롤-PB로 교체하고 4°C에서 최소 2시간 동안 보관합니다.
9. 몇 주 내에 7단계의 절차를 수행합니다.

7. 냉동 절편 및 면역 조직 화학

1. 웰 1에 동일한 부피의 조직 동결 매체와 30% 글리세롤-PB의 혼합물 1000μL를 추가하여 24웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 1000μL의 조직 동결 배지를 well 2에 추가합니다.
2. 슬라이스를 웰 1로 옮기고 4°C에서 1시간 동안 플레이트를 흔듭니다.
3. 슬라이스를 웰 2로 옮기고 4°C에서 1시간 동안 플레이트를 흔듭니다.
4. 드라이 아이스를 사용하여 이소펜탄으로 슬라이스를 빠르게 동결하고 슬라이스가 구부러지지 않도록 주의하십시오. 동결 절편까지 슬라이스를 -80 °C에서 보관하십시오.
5. 슬라이스를 6μm 두께로 극저온 절편합니다. 현미경 슬라이드를 건조시킨 후 -80 °C에서 섹션을 보관하십시오.
6. 항원 회수¹⁷의 경우, 절편을 10mM 구연산나트륨(pH 6.0)에 담그고 100°C로 한 번 가열한 다음 98°C에서 1시간 동안 유지합니다.
7. 증류수로 섹션을 광범위하게 씻으십시오. 이제 절편은 면역조직화학 염색을 위한 준비가 되었습니다.

결과

그림 1A 는 BSW의 시작과 관련된 염료 주입의 시간 경과를 보여주며, 최대 과압은 25kPa입니다. 'Post' 프로토콜에서 Evans blue solution은 FITC-dextran 관류 2시간 전에 혈관 내 투여되었으며, 이는 BSW 노출 후 6시간, 1일, 3일 및 7일 후에 수행되었습니다. 'Pre' 프로토콜에서 Evans 블루 용액은 BSW 노출 직전에 주입되었습니다. 'Post' 프로토콜에서 Evans blue의 농도는 ?...

토론

Evans blue와 FITC-dextran을 사용하는 새로운 이중 라벨링 기술을 사용하여 단일 뇌에서 BBB 파괴의 정확한 시공간 분포를 정확하게 시각화했습니다. 저강도 BSW 모델에서는 검사된 뇌에서 염료 유출의 범위, 위치 및 정도에서 눈에 띄는 변화가 관찰되었습니다(그림 2 및 그림 3). 염료 간 불일치는 BSW 노출 후 약 3시간 후에 BBB 분해가 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol