Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Resumo

Um método foi desenvolvido para visualizar o extravasamento de corante devido à quebra da barreira hematoencefálica (BBB), administrando dois corantes fluorescentes a camundongos em diferentes momentos. O uso do glicerol como crioprotetor facilitou a imuno-histoquímica na mesma amostra.

Resumo

Os corantes fluorescentes são usados para determinar a extensão do extravasamento de corante que ocorre devido à quebra da barreira hematoencefálica (BHE). A marcação com esses corantes é um processo complexo influenciado por vários fatores, como a concentração de corantes no sangue, permeabilidade dos vasos cerebrais, duração do extravasamento do corante e redução da concentração do corante no tecido devido à degradação e difusão. Em um modelo de lesão cerebral traumática leve, a exposição a ondas de choque induzidas por explosão (BSWs) desencadeia o colapso da BBB dentro de uma janela de tempo limitada. Para determinar a sequência precisa da quebra da BHE, o azul de Evans e o isotiocianato-dextrano de fluoresceína foram injetados por via intravascular e intracárdica em camundongos em vários pontos de tempo em relação à exposição à BSW. A distribuição da fluorescência do corante em fatias de cérebro foi então registrada. As diferenças na distribuição e intensidade entre os dois corantes revelaram a sequência espaço-temporal da quebra da BHE. A imunocoloração das fatias cerebrais mostrou que as respostas astrocíticas e microgliais se correlacionaram com os locais de quebra da BHE. Este protocolo tem amplo potencial de aplicação em estudos envolvendo diferentes modelos de quebra de BHE.

Introdução

A quebra e disfunção da barreira hematoencefálica (BHE) são causadas por inflamação sistêmica, infecções, doenças autoimunes, lesões e doenças neurodegenerativas¹. No traumatismo cranioencefálico leve (TCEm) resultante da exposição a ondas de choque induzidas por explosão (BSWs), foi observada uma correlação significativa entre a intensidade dos BSWs e a quantidade de vazamento de corante fluorescente devido à quebra do BBB ^2,3,4. Uma característica notável da quebra da BBB no mTBI é que ela começa imediatamente ou dentro de algumas horas após a exposição a BSWs e geralmente é um processo transitório que dura cerca de uma semana antes do surgimento de distúrbios neurológicos crônicos tardios 3,5,6,7. Embora os detalhes permaneçam obscuros, a quebra da BHE faz parte da cascata patológica de longa duração e também pode servir como um fator prognóstico no mTBI⁶. Portanto, é importante entender as distribuições espaciais e temporais da quebra da BHE no cérebro.

Corantes fluorescentes são usados para determinar a extensão da quebra da BHE ^3,8. Como a concentração sanguínea dos corantes e a magnitude e extensão da quebra da BHE mudam com o tempo, é necessário cautela ao interpretar imagens de extravasamento de corante. Por exemplo, a ausência de extravasamento de corante não indica necessariamente a ausência de quebra de BBB. Nenhuma quebra de BBB pode ser detectada antes ou depois de um aumento na concentração sanguínea do corante. Mesmo que o corante tenha se acumulado com sucesso onde ocorreu a quebra do BBB, ele pode ter sido perdido ao longo do tempo após o término da quebra. Em geral, substâncias solúveis em água e biologicamente inertes são rapidamente excretadas na urina⁹. Portanto, para determinar se a quebra da BBB ocorre em um momento específico, os resultados mais confiáveis são obtidos quando um corante fluorescente é administrado na corrente sanguínea por um curto período imediatamente antes da fixação do animal. Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano comercialmente disponível com um peso molecular específico deve ser usado dessa maneira.

O azul de Evans é um corante azo azul amplamente reconhecido com uma forte afinidade pela albumina sérica. O corante exibe fluorescência vermelha quando excitado pela luz verde em sistemas biológicos². Devido à sua natureza inerte, o complexo albumina de soro azul de Evans permanece no sangue por até 2 h, tornando-o um marcador útil de 69 kDa para marcar regiões com BBB comprometida por pelo menos esse período^10,11. Portanto, é importante considerar possíveis incertezas em torno da farmacocinética e toxicidade do azul de Evans⁹. No entanto, um estudo recente mostrou que o azul de Evans continua a se acumular em áreas onde a BHE está ausente ou interrompida⁷. Esse recurso permitiu que o Evans Blue registrasse o histórico da quebra do BBB, enquanto o FITC-dextrano foi usado para registrar o colapso do BBB em um ponto de tempo específico após a exposição ao BSW. Embora o azul de Evans possa ser administrado por via intravenosa ou intraperitoneal¹⁰, a administração intravenosa é preferida para experimentos sensíveis ao tempo. Este estudo teve como objetivo demonstrar o uso do azul de Evans e do FITC-dextrano para detectar a distribuição espaço-temporal da quebra da BHE após a exposição à BSW.

Em segundo lugar, o estudo apresentou uma técnica para congelar fatias de cérebro após observar a fluorescência da quebra da BHE e preparar fatias mais finas adequadas para procedimentos imuno-histoquímicos. O uso de glicerol como meio de montagem e crioprotetor simplifica o processo de imuno-histoquímica. Ao comparar as imagens de quebra de BBB com as de imuno-histoquímica, a distribuição espaço-temporal de BBB

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas para experimentos com animais estabelecidas pelo National Defense Medical College (Tokorozawa, Japão). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina da Defesa Nacional (parecer nº 23011-1). Camundongos C57BL/6J machos com 8 semanas de idade e pesando 19-23 g foram utilizados neste estudo. Conforme ilustrado na Figura 1, uma única injeção de azul de Evans e perfusão de FITC-dextrana foram realizadas em vários momentos em relação a uma única exposição BSW. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Anestesia

NOTA: Este é um protocolo modificado que aumenta a quantidade de medetomidina em 2,5 vezes em comparação com o original¹². As dosagens de cloridrato de medetomidina, midazolam e butorfanol foram de 0,75 mg / kg, 4 mg / kg e 5 mg / kg, respectivamente.

1. Prepare uma mistura de cloridrato de medetomidina (75 μg / mL), midazolam (400 μg / mL) e butorfanol (500 μg / mL) em solução salina fisiológica.
2. Administrar a mistura por via intraperitoneal para anestesiar o camundongo (10 μL/g)¹³.
3. Após aproximadamente 5-10 min, verifique anestesia suficiente observando a ausência de pinça da cauda e reflexos de retirada do pedal.
4. Mantenha o mouse aquecido até que ele se recupere dos efeitos da anestesia.

2. Exposição BSW

NOTA: Um tubo de choque interno foi usado neste estudo¹⁴.

1. Anestesiar o mouse conforme descrito na etapa 1.
2. Posicione o mouse a 5 cm de distância da extremidade de saída do tubo de choque, certificando-se de que o eixo do corpo esteja paralelo, mas não alinhado com o eixo do tubo.
3. Forneça uma única exposição BSW com um pico de sobrepressão de 25 kPa na cabeça.
   NOTA: Mantenha o mouse aquecido até que ele se recupere dos efeitos da anestesia. Monitore regularmente a condição do camundongo tratado. Se forem observados sinais de angústia, como dificuldade para se alimentar ou beber, curvar-se ou aparência anormal prolongada sem sinais de recuperação, sacrificar o camundongo e encerrar o experimento mais cedo. Evite administrar analgésicos, pois eles podem afetar a resposta glial.

3. Injeção azul de Evans na veia da cauda

NOTA: A solução de azul de Evans deve ser administrada por via intravenosa sem anestesia. Na presença de anestesia, o corante muitas vezes não penetra suficientemente no corpo, provavelmente devido à diminuição da pressão arterial e da temperatura corporal¹³. O azul de Evans foi administrado na dose de 100 mg / kg.

1. Prepare a solução de azul de Evans (4% p / v em solução salina) em um microtubo, depois vortex e armazene-o no escuro antes de usar.
2. Injetar a solução na veia caudal (2,5 μL/g)¹³.

4. Perfusão transcárdica com solução de FITC-dextrana e fixação

1. Adicione heparina à solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma concentração de 1 U/mL e, em seguida, adicione FITC-dextrano ao PBS heparinizado para atingir uma concentração de 3 mg/mL.
2. Dissolva completamente o pó de dextrano FITC antes de usar. Para fazer isso, agite suavemente a solução por 30 min ou mais. Antes de usar, verifique cuidadosamente se há pó de dextrano FITC não dissolvido. Se sobrar algum, continue agitando até que esteja completamente dissolvido.
3. Anestesiar o mouse conforme descrito na etapa 1.
4. Prossiga com o protocolo padrão de fixação de perfusão usando uma bomba peristáltica^15,16. Primeiro, perfunda com PBS heparinizado contendo FITC-dextrano por 2 min a uma taxa de 4,0 mL / min. Em seguida, perfunda com solução tampão neutra de formalina a 10% ou paraformaldeído-PBS a 4% por 2 min a uma taxa de 4,0 mL / min, seguido de 8 min a uma taxa de 3,5 mL / min.
5. Remova cuidadosamente o cérebro com tesoura cirúrgica e pinça^15,16. Após a dissecção, pós-fixar o cérebro durante a noite no mesmo fixador (ou seja, solução tampão neutra de formalina a 10% ou paraformaldeído-PBS a 4%) a 4 °C.
6. No dia seguinte, substitua o fixador por PBS.

5. Processamento de tecido cerebral

NOTA: Mesmo que a fixação da perfusão esteja completa, o azul de Evans e o dextrano FITC podem se dispersar no tampão. Portanto, os procedimentos que levam ao passo 6.8 devem ser concluídos dentro de uma semana após a fixação da perfusão. Além disso, evite expor a amostra à luz.

1. Prepare uma placa de 24 poços com 500 μL de glicerol a 20% em tampão fosfato (PB; pH 7,4) em cada poço.
2. Usando um cortador de cérebro, corte o cérebro coronalmente em 12 fatias, cada uma com 1 mm de espessura.
3. Transferir cada fatia para o alvéolo correspondente da placa de 24 poços e conservá-la a 4 °C durante, pelo menos, 2 h.
4. Substitua a solução por glicerol-PB a 50% e armazene-a a 4 ° C por pelo menos 2 h.
5. Por fim, substitua a solução por glicerol 100%. Para observação microscópica imediata, deixar as fatias repousarem durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente ou conservá-las a 4 °C. As fatias agora serão translúcidas e prontas para observação microscópica.

6. Medição de fluorescência do extravasamento de corante

NOTA: A eficiência da rotulagem de fluorescência varia de mouse para mouse. Portanto, a intensidade da fluorescência precisa ser normalizada. Os valores de fluorescência são expressos em relação aos do núcleo reticular gigantocelular (GRN) porque essa região é minimamente afetada pelo tratamento BSW.

1. Adicione 500 μL de glicerol ao fundo de um prato com fundo de vidro de 35 mm.
2. Transfira a fatia para a solução de glicerol e cubra sua superfície com uma lamínula.
3. Remova o excesso de glicerol da borda da lamínula.
4. Meça a intensidade de fluorescência da fatia sob um microscópio de fluorescência.
5. Após a medição microscópica, retorne a fatia ao poço.
6. Repita a medição para todas as 12 fatias.
7. Adicionar 500 μL de PB a cada alvéolo e conservar a placa de 24 poços a 4 °C durante a noite; no dia seguinte, as fatias serão saturadas com glicerol-PB a 50%.
8. Substitua a solução por glicerol-PB a 30% e armazene-a a 4 °C por pelo menos 2 h.
9. Execute os procedimentos na etapa 7 dentro de algumas semanas.

7. Crioseccionamento e imuno-histoquímica

1. Prepare uma placa de 24 poços adicionando 1000 μL de uma mistura de volumes iguais de meio de congelamento de tecido e 30% de glicerol-PB ao poço 1. Em seguida, adicione 1000 μL de meio de congelamento de tecido ao poço 2.
2. Transfira a fatia para o poço 1 e agite a placa a 4 °C durante 1 h.
3. Transferir a fatia para o poço 2 e agitar a placa a 4 °C durante 1 h.
4. Congele rapidamente a fatia com isopentano usando gelo seco, tomando cuidado para não dobrar a fatia. Conservar as fatias a -80 °C até à criosecção.
5. Criosecção: a fatia com uma espessura de 6 μm. Após a secagem na lâmina do microscópio, armazene as seções a -80 °C.
6. Para a recuperação do antígeno¹⁷, mergulhe as seções em citrato de sódio 10 mM (pH 6,0), aqueça a 100 ° C uma vez e mantenha a 98 ° C por 1 h.
7. Lave extensivamente as seções em água destilada. As seções agora estão prontas para coloração imuno-histoquímica.

Resultados

A Figura 1A mostra o curso do tempo de injeção do corante em relação ao início da BSW, com um pico de sobrepressão de 25 kPa. No protocolo 'Pós', a solução de azul de Evans foi administrada por via intravascular 2 h antes da perfusão com dextrana FITC, que foi realizada 6 h, 1 dia, 3 dias e 7 dias após a exposição ao BSW. No protocolo 'Pré', a solução de azul de Evans foi injetada imediatamente antes da exposição ao BSW. No protocolo 'Pós'...

Discussão

Uma nova técnica de rotulagem dupla usando azul de Evans e FITC-dextrano foi usada para visualizar com precisão a distribuição espaço-temporal precisa da quebra da BBB em um único cérebro. No modelo BSW de baixa intensidade, variações perceptíveis na extensão, localização e grau de extravasamento de corante foram observadas nos cérebros examinados (Figura 2 e Figura 3). As incompatibilidades entre os corantes revel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol