Оценка разрушения гематоэнцефалического барьера на мышиной модели легкой черепно-мозговой травмы

Резюме

Был разработан метод визуализации экстравазации красителя из-за разрушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) путем введения двух флуоресцентных красителей мышам в разные моменты времени. Использование глицерина в качестве криопротектора способствовало иммуногистохимии на том же образце.

Аннотация

Флуоресцентные красители используются для определения степени экстравазации красителя, которая происходит из-за разрушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Мечение этими красителями является сложным процессом, на который влияют несколько факторов, таких как концентрация красителей в крови, проницаемость сосудов головного мозга, продолжительность экстравазации красителя и снижение концентрации красителя в ткани из-за деградации и диффузии. В модели легкой черепно-мозговой травмы воздействие ударных волн, вызванных взрывом (BSW), вызывает разрушение BBB в течение ограниченного временного окна. Для определения точной последовательности распада ГЭБ синий Эванса и флуоресцеин изотиоцианат-декстран вводили мышам внутрисосудисто и интракардиально в различные моменты времени относительно воздействия ББО. Затем было зарегистрировано распределение флуоресценции красителя в срезах мозга. Различия в распределении и интенсивности между двумя красителями выявили пространственно-временную последовательность распада ГЭБ. Иммуноокрашивание срезов мозга показало, что астроцитарные и микроглиальные реакции коррелируют с местами распада ГЭБ. Этот протокол имеет широкий потенциал для применения в исследованиях с использованием различных моделей пробоя ГЭБ.

Введение

Разрушение и дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) вызваны системным воспалением, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, травмами и нейродегенеративными заболеваниями¹. При легкой черепно-мозговой травме (ЧМТ), возникшей в результате воздействия ударных волн, вызванных взрывом (ЧМТ), наблюдалась значимая корреляция между интенсивностью ЧМТ и величиной утечки флуоресцентного красителя из-за пробоя ГЭБ ^2,3,4. Одной из примечательных особенностей распада ГЭБ при ЧМТ является то, что он начинается сразу или в течение нескольких часов после воздействия ЧМТ и обычно является преходящим процессом, который длится около недели, прежде чем появятся отсроченные хронические неврологические расстройства. Хотя детали остаются неясными, распад ГЭБ является частью длительного патологического каскада и также может служить прогностическим фактором при ЧМТ⁶. Поэтому важно понимать пространственное и временное распределение распада ГЭБ в мозге.

Флуоресцентные красители используются для определения степени распада ГЭБ ^3,8. Поскольку концентрация красителей в крови, а также величина и степень распада ГЭБ изменяются со временем, требуется осторожность при интерпретации изображений экстравазации красителя. Например, отсутствие экстравазации красителя не обязательно указывает на отсутствие распада ГЭБ. Распад ГЭБ не может быть обнаружен ни до, ни после повышения концентрации красителя в крови. Даже если краситель успешно накопился в месте распада BBB, он мог быть потерян со временем после того, как распад прекратился. В целом, водорастворимые и биологически инертные вещества быстро выводятся с мочой⁹. Поэтому для определения того, происходит ли распад ГЭБ в конкретное время, наиболее достоверные результаты получаются при введении флуоресцентного красителя в кровоток на короткий период непосредственно перед фиксацией животного. Таким образом следует использовать коммерчески доступный флуоресцеин изотиоцианат (ФИТК)-декстран с определенной молекулярной массой.

Evans blue — широко известный синий азокраситель с сильным сродством к сывороточному альбумину. Краситель проявляет красную флуоресценцию при возбуждении зеленым светом в биологических системах². Из-за своей инертной природы синесывороточный альбуминный комплекс Эванса остается в крови до 2 ч, что делает его полезным индикатором 69 кДа для мечения областей с скомпрометированным ГЭБ в течение как минимум этого времени ^10,11. Поэтому важно учитывать потенциальные неопределенности, связанные с фармакокинетикой и токсичностью синего^{Эванса 9}. Тем не менее, недавнее исследование показало, что синий цвет Эванса продолжает накапливаться в областях, где ГЭБ отсутствует или нарушен⁷. Эта функция позволила Эвансу Блю записать историю пробоя ГЭБ, в то время как ФИТК-декстран использовался для записи пробоя ГЭБ в определенный момент времени после воздействия ББВ. Хотя Evans blue можно вводить внутривенно или внутрибрюшинно10, внутривенное введение предпочтительно для экспериментов, чувствительных ко времени. Это исследование было направлено на демонстрацию использования синего Эванса и ФИТК-декстрана для обнаружения пространственно-временного распределения распада ГЭБ после воздействия БМВ.

Во-вторых, в исследовании была представлена техника замораживания срезов мозга после наблюдения за флуоресценцией распада ГЭБ и получения более тонких срезов, пригодных для иммуногистохимических процедур. Использование глицерина в качестве монтажной среды и криопротектора упрощает процесс иммуногистохимии. Сравнивая изображения распада ГЭБ с изображениями иммуногистохимии, пространственно-временное распределение распада ГЭБ может быть коррелировано с реакцией тканей того же образца.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами для экспериментов на животных, установленными Национальным медицинским колледжем обороны (Токорозава, Япония). Протокол исследования был одобрен Комитетом по исследованиям на животных Медицинского колледжа Национальной обороны (одобрение No 23011-1). В исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель и массой 19-23 г. Как показано на рисунке 1, однократная инъекция синего цвета Эванса и перфузия FITC-декстрана выполнялись в различные моменты времени в связи с однократным воздействием BSW. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Анестезия

ПРИМЕЧАНИЕ: Это модифицированный протокол, который увеличивает количество медетомидина в 2,5 раза по сравнению с исходным¹². Дозировки медетомидина гидрохлорида, мидазолама и буторфанола составляли 0,75 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг соответственно.

1. Приготовьте смесь медетомидина гидрохлорида (75 мкг/мл), мидазолама (400 мкг/мл) и буторфанола (500 мкг/мл) в физиологическом растворе.
2. Вводите смесь внутрибрюшинно для обезболивания мыши (10 мкл/г)¹³.
3. Примерно через 5-10 минут убедитесь в достаточной анестезии, наблюдая за отсутствием рефлексов защемления хвоста и отвода педалей.
4. Держите мышь в тепле до тех пор, пока она не оправится от последствий анестезии.

2. Подверженность BSW

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалась электрошоковая трубка собственного производства¹⁴.

1. Обезболите мышь, как описано в шаге 1.
2. Расположите мышь на расстоянии 5 см от выходного конца ударной трубки, убедившись, что ось ее корпуса параллельна, но не выровнена по оси трубки.
3. Подайте в голову однократное воздействие BSW с пиковым избыточным давлением 25 кПа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышь в тепле, пока она не оправится от последствий анестезии. Регулярно контролируйте состояние обработанной мыши. Если наблюдаются признаки дистресса, такие как трудности с кормлением или питьем, сгорбливание или длительный аномальный внешний вид без признаков выздоровления, усыпьте мышь и прекратите эксперимент досрочно. Избегайте введения анальгетиков, так как они потенциально могут повлиять на глиальную реакцию.

3. Инъекция Evans blue в хвостовую вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Evans blue следует вводить внутривенно без анестезии. При наличии анестезии краситель часто недостаточно проникает в организм, вероятно, из-за снижения артериального давления^{и температуры тела}. Эванс синий вводили в дозе 100 мг/кг.

1. Приготовьте раствор синего Эванса (4% по весу в физрастворе) в микропробирке, затем смешайте и храните в темноте перед использованием.
2. Введите раствор в хвостовую вену (2,5 μл/г)¹³.

4. Транскардиальная перфузия раствором ФИТК-декстрана и фиксация

1. Добавьте гепарин в фосфатно-солевой буфер (PBS) для получения концентрации 1 Ед/мл, затем добавьте FITC-декстран к гепаринизированному PBS для достижения концентрации 3 мг/мл.
2. Перед применением полностью растворите порошок ФИТК-декстрана. Для этого нужно аккуратно встряхивать раствор в течение 30 мин или более. Перед использованием тщательно проверьте наличие нерастворенного порошка FITC-декстрана. Если что-то осталось, продолжайте встряхивать до полного его растворения.
3. Обезболите мышь, как описано в шаге 1.
4. Продолжайте работу по стандартному протоколу перфузионной фиксации с помощью перистальтического насоса^15,16. Сначала проводят перфузию гепаринизированным PBS, содержащим FITC-декстран, в течение 2 мин со скоростью 4,0 мл/мин. Затем перфузируют 10% нейтральным буферным раствором формалина или 4% параформальдегидом-PBS в течение 2 мин со скоростью 4,0 мл/мин, а затем 8 мин со скоростью 3,5 мл/мин.
5. Аккуратно удалите мозг с помощью хирургических ножниц и пинцета^15,16. После вскрытия зафиксируйте мозг на ночь в том же фиксаторе (т.е. 10% нейтральном буферном растворе формалина или 4% параформальдегиде-PBS) при температуре 4 °C.
6. На следующий день замените фиксатор на PBS.

5. Обработка тканей мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если фиксация перфузии завершена, синий Эванса и ФИТК-декстран могут дисперсировать в буфере. Таким образом, процедуры, ведущие к шагу 6.8, должны быть завершены в течение недели после перфузионной фиксации. Кроме того, не подвергайте образец воздействию света.

1. Приготовьте 24-луночный планшет с 500 мкл 20% глицерина в фосфатном буфере (PB; pH 7,4) в каждой лунке.
2. С помощью слайсера для мозга разрежьте мозг коронально на 12 срезов, каждый толщиной 1 мм.
3. Переложите каждый ломтик в соответствующую лунку 24-луночного планшета и храните его при температуре 4 °C не менее 2 часов.
4. Замените раствор 50% глицерином-PB и храните его при температуре 4 °C не менее 2 часов.
5. Наконец, замените раствор на 100% глицерин. Для немедленного микроскопического наблюдения дайте ломтикам постоять не менее 2 часов при комнатной температуре или храните их при температуре 4 °C. Теперь срезы будут полупрозрачными и готовыми к микроскопическому наблюдению.

6. Флуоресцентное измерение экстравазации красителя

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность флуоресцентного мечения варьируется от мыши к мыши. Поэтому интенсивность флуоресценции необходимо нормализовать. Значения флуоресценции выражаются относительно значений в пределах гигантоцеллюлярного ретикулярного ядра (GRN), поскольку эта область минимально поражается при лечении BSW.

1. Добавьте 500 μL глицерина на дно 35-миллиметровой посуды со стеклянным дном.
2. Переложите срез в раствор глицерина и накройте его поверхность покровным стеклом.
3. Удалите излишки глицерина с края покровного стекла.
4. Измерьте интенсивность флуоресценции среза под флуоресцентным микроскопом.
5. После микроскопических измерений верните срез в лунку.
6. Повторите измерение для всех 12 ломтиков.
7. Добавьте 500 μL PB в каждую лунку и храните 24-луночный планшет при температуре 4 °C в течение ночи; на следующий день ломтики будут насыщены 50% глицерином-PB.
8. Замените раствор 30% глицерином-PB и храните при температуре 4 °C не менее 2 часов.
9. Выполните процедуры, описанные на шаге 7, в течение нескольких недель.

7. Криосекция и иммуногистохимия

1. Приготовьте 24-луночный планшет, добавив в лунку 1000 мкл смеси равных объемов тканевой замораживающей среды и 30% глицерина-PB. Затем добавьте 1000 μл тканевой среды для замораживания в лунку 2.
2. Переложите ломтик в лунку 1 и встряхивайте тарелку при температуре 4 °C в течение 1 часа.
3. Переложите ломтик в лунку 2 и встряхивайте тарелку при температуре 4 °C в течение 1 часа.
4. Быстро заморозьте ломтик изопентаном с помощью сухого льда, стараясь не загнуть ломтик. Храните ломтики при температуре -80 °C до криосекции.
5. Криосекция среза до толщины 6 мкм. После высыхания на предметном стекле микроскопа храните срезы при температуре -80 °C.
6. Для извлечения антигена¹⁷ срезы погружают в 10 мМ цитрат натрия (pH 6,0), нагревают до 100 °C один раз, а затем поддерживают при 98 °C в течение 1 ч.
7. Тщательно промойте срезы в дистиллированной воде. В настоящее время срезы готовы к иммуногистохимическому окрашиванию.

Результаты

На рисунке 1А показан временной ход введения красителя в зависимости от начала BSW с пиковым избыточным давлением 25 кПа. В протоколе «Post» раствор синего Эванса вводили внутрисосудисто за 2 ч до перфузии FITC-декстрана, которая проводилась через 6 ч, 1 день, 3 ...

Обсуждение

Новая техника двойного мечения с использованием синего цвета Эванса и FITC-декстрана была использована для точной визуализации точного пространственно-временного распределения распада ГЭБ в одном мозге. В модели низкой интенсивности BSW в исследуемом мозге наблюдалис...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol