Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פותחה שיטה להמחשת אקסטרוואזציה של צבע עקב פירוק מחסום דם-מוח (BBB) על ידי מתן שני צבעים פלואורסצנטיים לעכברים בנקודות זמן שונות. השימוש בגליצרול כחומר קריאופרוטקטנט הקל על אימונוהיסטוכימיה באותה דגימה.

Abstract

צבעים פלואורסצנטיים משמשים לקביעת מידת הוצאת הצבע המתרחשת עקב פירוק מחסום הדם-מוח (BBB). תיוג עם צבעים אלה הוא תהליך מורכב המושפע ממספר גורמים, כגון ריכוז הצבעים בדם, חדירות כלי המוח, משך הוצאת הצבע והפחתת ריכוז הצבע ברקמה עקב פירוק ודיפוזיה. במודל פגיעה מוחית טראומטית קלה, חשיפה לגלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ (BSWs) גורמת להתמוטטות BBB בחלון זמן מוגבל. כדי לקבוע את הרצף המדויק של פירוק BBB, אוונס כחול ופלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן הוזרקו תוך וסקולרית ותוך קרדיאלית לעכברים בנקודות זמן שונות ביחס לחשיפה ל-BSW. לאחר מכן נרשמה התפלגות הקרינה של הצבע בפרוסות המוח. הבדלים בפיזור ובעוצמה בין שני הצבעים חשפו את הרצף המרחבי-זמני של התמוטטות ה-BBB. צביעה חיסונית של פרוסות המוח הראתה שתגובות אסטרוציטיות ומיקרוגליאליות היו בקורלציה עם אתרי התמוטטות BBB. לפרוטוקול זה יש פוטנציאל רחב ליישום במחקרים הכוללים מודלים שונים של פירוק BBB.

Introduction

התמוטטות מחסום דם-מוח (BBB) ותפקוד לקוי נגרמים על ידי דלקת מערכתית, זיהומים, מחלות אוטואימוניות, פציעות ומחלות ניווניות1. בפגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) הנובעת מחשיפה לגלי הלם הנגרמים על ידי פיצוץ (BSWs), נצפה מתאם מובהק בין עוצמת BSWs לכמות דליפת הצבע הפלואורסצנטי עקב התמוטטות BBB 2,3,4. מאפיין בולט אחד של פירוק BBB ב-mTBI הוא שהוא מתחיל מיד או תוך מספר שעות לאחר החשיפה ל-BSWs ובדרך כלל הוא תהליך חולף שנמשך כשבוע לפני הופעת הפרעות נוירולוגיות כרוניות מעוכבות 3,5,6,7. למרות שהפרטים נותרו לא ברורים, התמוטטות BBB היא חלק מהמפל הפתולוגי ארוך הטווח ועשויה לשמש גם כגורם פרוגנוסטי ב-mTBI6. לכן, הבנת ההתפלגות המרחבית והזמנית של פירוק BBB במוח חשובה.

צבעים פלואורסצנטיים משמשים לקביעת היקף פירוק ה-BBB 3,8. מכיוון שריכוז הצבעים בדם וגודל והיקף פירוק ה-BBB משתנים עם הזמן, נדרשת זהירות בעת פירוש תמונות של אקסטרוואזציה של צבעים. לדוגמה, היעדר אקסטרוואזציה של צבע אינו מעיד בהכרח על היעדר פירוק BBB. לא ניתן לזהות פירוק BBB לפני או אחרי עלייה בריכוז הצבע בדם. גם אם הצבע הצטבר בהצלחה במקום בו התרחשה התמוטטות BBB, ייתכן שהוא אבד עם הזמן לאחר הפסקת הפירוק. באופן כללי, חומרים מסיסים במים ואינרטיים ביולוגית מופרשים במהירות בשתן9. לכן, כדי לקבוע אם פירוק BBB מתרחש בזמן מסוים, מתקבלות התוצאות האמינות ביותר כאשר צבע פלואורסצנטי מוזרק לזרם הדם לתקופה קצרה מיד לפני תיקון החיה. יש להשתמש באופן זה בפלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן בעל משקל מולקולרי ספציפי.

כחול אוונס הוא צבע אזו כחול מוכר עם זיקה חזקה לאלבומין בסרום. הצבע מציג פלואורסצנטיות אדומה כאשר הוא נרגש על ידי אור ירוק במערכות ביולוגיות2. בשל אופיו האינרטי, קומפלקס האלבומין הכחול של אוונס נשאר בדם עד שעתיים, מה שהופך אותו לעוקב שימושי של 69 kDa לתיוג אזורים עם BBB שנפגע למשך זמן זה לפחות 10,11. לכן, חשוב לקחת בחשבון אי ודאות פוטנציאלית סביב הפרמקוקינטיקה והרעילות של אוונס כחול9. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי כחול אוונס ממשיך להצטבר באזורים שבהם ה-BBB נעדר או מופרע7. תכונה זו אפשרה לאוונס בלו לתעד את ההיסטוריה של התמוטטות ה-BBB, בעוד ש-FITC-dextran שימש לתיעוד התמוטטות ה-BBB בנקודת זמן מסוימת לאחר החשיפה ל-BSW. למרות שניתן לתת אוונס כחול תוך ורידי או תוך צפקי10, מתן תוך ורידי מועדף לניסויים רגישים לזמן. מחקר זה נועד להדגים את השימוש בכחול אוונס ו-FITC-dextan כדי לזהות את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פירוק BBB בעקבות חשיפה ל-BSW.

שנית, המחקר הציג טכניקה להקפאת פרוסות מוח לאחר התבוננות בפלואורסצנטיות של פירוק BBB והכנת פרוסות דקות יותר המתאימות להליכים אימונוהיסטוכימיים. השימוש בגליצרול כמדיום הרכבה וכחומר הקפאה מפשט את תהליך האימונוהיסטוכימיה. על ידי השוואת תמונות של התמוטטות BBB עם אלה מאימונוהיסטוכימיה, ניתן לתאם את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פירוק BBB עם תגובת הרקמה של אותה דגימה.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות האתיות לניסויים בבעלי חיים שנקבעו על ידי המכללה הרפואית להגנה לאומית (טוקורוזאווה, יפן). פרוטוקול המחקר אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים במכללה הרפואית להגנה לאומית (אישור מס' 23011-1). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני 8 שבועות ובמשקל 19-23 גרם. כפי שמוצג באיור 1, הזרקה בודדת של אוונס כחול וזלוף FITC-dextran בוצעו בנקודות זמן שונות ביחס לחשיפה בודדת ל-BSW. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הרדמה

הערה: זהו פרוטוקול מותאם שמגדיל את כמות המדטומידין פי 2.5 בהשוואה לפרוטוקול המקוריפי 12. המינונים של מדטומידין הידרוכלוריד, מידזולם ובוטאורפנול היו 0.75 מ"ג/ק"ג, 4 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג, בהתאמה.

  1. הכינו תערובת של מדטומידין הידרוכלוריד (75 מיקרוגרם/מ"ל), מידזולם (400 מיקרוגרם/מ"ל) ובוטאורפנול (500 מיקרוגרם/מ"ל) בתמיסת מלח פיזיולוגית.
  2. יש לתת את התערובת תוך צפקית כדי להרדים את העכבר (10 מיקרוליטר/גרם)13.
  3. לאחר כ-5-10 דקות, ודא הרדמה מספקת על ידי התבוננות בהיעדר צביטת זנב ורפלקסים של נסיגת דוושה.
  4. שמור על חום העכבר עד שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה.

2. חשיפה ל-BSW

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בצינור הלם פנימי14.

  1. הרדמו את העכבר כמתואר בשלב 1.
  2. מקם את העכבר במרחק של 5 ס"מ מקצה היציאה של צינור ההלם, וודא שציר הגוף שלו מקביל לציר הצינור אך אינו מיושר איתו.
  3. ספק חשיפה בודדת ל-BSW עם לחץ יתר שיא של 25 kPa לראש.
    הערה: שמור על חום העכבר עד שהוא מתאושש מהשפעות ההרדמה. עקוב באופן קבוע אחר מצבו של העכבר המטופל. אם נצפים סימני מצוקה, כגון קושי בהאכלה או שתייה, התכופפות או הופעה חריגה ממושכת ללא סימני התאוששות, יש להמית את העכבר ולסיים את הניסוי מוקדם. הימנע ממתן משככי כאבים, מכיוון שהם עלולים להשפיע על תגובת הגליה.

3. הזרקה כחולה של אוונס לווריד הזנב

הערה: יש לתת את התמיסה הכחולה של אוונס דרך הווריד ללא הרדמה. בנוכחות הרדמה, הצבע לרוב אינו חודר לגוף מספיק, ככל הנראה עקב ירידה בלחץ הדם וטמפרטורת הגוף13. אוונס בלו ניתן במינון של 100 מ"ג/ק"ג.

  1. הכינו את התמיסה הכחולה של אוונס (4% משקל/נפח במי מלח) במיקרו-צינור, ולאחר מכן מערבולת ואחסנו אותה בחושך לפני השימוש.
  2. להזריק את התמיסה לווריד הזנב (2.5 מיקרוליטר/גרם)13.

4. זלוף טרנסקרדיאלי עם תמיסת FITC-dextran וקיבוע

  1. הוסף הפרין לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) כדי לקבל ריכוז של 1 U/mL, ולאחר מכן הוסף FITC-dextan ל-PBS ההפריני כדי להשיג ריכוז של 3 מ"ג/מ"ל.
  2. יש להמיס לחלוטין את אבקת FITC-dextran לפני השימוש. לשם כך יש לנער בעדינות את התמיסה למשך 30 דקות ומעלה. לפני השימוש, בדוק היטב אם יש אבקת FITC-dextran לא מומסת. אם נשאר, המשיכו לנער עד להמסה מלאה.
  3. הרדמו את העכבר כמתואר בשלב 1.
  4. המשך עם פרוטוקול קיבוע הזלוף הסטנדרטי באמצעות משאבה פריסטלטית15,16. ראשית, לחלחל עם PBS הפריני המכיל FITC-dextran למשך 2 דקות בקצב של 4.0 מ"ל לדקה. לאחר מכן, יש להחדיר עם תמיסת חיץ ניטרלית פורמלין של 10% או 4% פרפורמלדהיד-PBS למשך 2 דקות בקצב של 4.0 מ"ל לדקה, ולאחר מכן 8 דקות בקצב של 3.5 מ"ל לדקה.
  5. הסר בזהירות את המוח באמצעות מספריים ופינצטה כירורגית15,16. לאחר הדיסקציה, יש לקבע את המוח למשך הלילה באותו קיבוע (כלומר, תמיסת חיץ ניטרלית פורמלין 10% או 4% פרפורמלדהיד-PBS) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. למחרת, החלף את הקיבוע ב- PBS.

5. עיבוד רקמות מוח

הערה: גם אם קיבוע הזלוף הושלם, כחול אוונס ו-FITC-dextán עלולים להתפזר לתוך המאגר. לכן, יש להשלים את ההליכים המובילים לשלב 6.8 תוך שבוע לאחר קיבוע הזלוף. בנוסף, הימנע מחשיפת הדגימה לאור.

  1. הכן צלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של 20% גליצרול במאגר פוספט (PB; pH 7.4) בכל באר.
  2. בעזרת פורס מוח, חותכים את המוח ל-12 פרוסות, כל אחת בעובי 1 מ"מ.
  3. מעבירים כל פרוסה לבאר המתאימה של צלחת 24 הבארות ושומרים אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  4. החלף את התמיסה ב-50% גליצרול-PB ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  5. לבסוף, החלף את התמיסה ב 100% גליצרול. לתצפית מיקרוסקופית מיידית, אפשר לפרוסות לעמוד לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפרוסות יהיו כעת שקופות ומוכנות לתצפית מיקרוסקופית.

6. מדידת פלואורסצנטיות של אקסטרוואזציה של צבע

הערה: יעילות תיוג הקרינה משתנה מעכבר לעכבר. לכן, יש לנרמל את עוצמת הקרינה. ערכי הקרינה באים לידי ביטוי ביחס לאלו שבתוך גרעין הרשתית הענק (GRN) מכיוון שאזור זה מושפע באופן מינימלי מטיפול BSW.

  1. הוסף 500 מיקרוליטר גליצרול לתחתית צלחת זכוכית 35 מ"מ.
  2. מעבירים את הפרוסה לתמיסת הגליצרול ומכסים את פני השטח שלה בכוס כיסוי.
  3. הסר עודפי גליצרול מקצה זכוכית הכיסוי.
  4. מדוד את עוצמת הקרינה של הפרוסה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  5. לאחר מדידה מיקרוסקופית מחזירים את הפרוסה לבאר.
  6. חזור על המדידה עבור כל 12 הפרוסות.
  7. מוסיפים 500 מיקרוליטר PB לכל באר ומאחסנים את צלחת 24 הבארות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה; למחרת, הפרוסות יהיו רוויות ב -50% גליצרול-PB.
  8. החלף את התמיסה ב-30% גליצרול-PB ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  9. בצע את ההליכים בשלב 7 תוך מספר שבועות.

7. קריוסקציה ואימונוהיסטוכימיה

  1. הכן צלחת של 24 בארות על ידי הוספת 1000 מיקרוליטר של תערובת של נפחים שווים של מדיום הקפאת רקמות ו -30% גליצרול-PB לבאר 1. לאחר מכן, הוסף 1000 מיקרוליטר של מדיום הקפאת רקמות לבאר 2.
  2. מעבירים את הפרוסה לבאר 1 ומנערים את הצלחת בחום של 4 מעלות למשך שעה.
  3. מעבירים את הפרוסה לבאר 2 ומנערים את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. הקפיאו במהירות את הפרוסה עם איזופנטן בעזרת קרח יבש, הקפידו לא לכופף את הפרוסה. אחסן את הפרוסות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.
  5. חתכו בהקפאה את הפרוסה לעובי של 6 מיקרומטר. לאחר הייבוש בשקופית המיקרוסקופ, אחסן את החלקים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  6. לאחזור אנטיגן17, טבלו את החלקים ב-10 מ"מ נתרן ציטראט (pH 6.0), חממו ל-100 מעלות צלזיוס פעם אחת, ולאחר מכן שמרו על 98 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  7. שוטפים את החלקים בהרחבה במים מזוקקים. החלקים מוכנים כעת לצביעה אימונוהיסטוכימית.

תוצאות

איור 1A מציג את מהלך הזמן של הזרקת הצבע ביחס להופעת BSW, עם לחץ יתר שיא של 25 kPa. בפרוטוקול 'פוסט', התמיסה הכחולה של אוונס ניתנה תוך וסקולרית שעתיים לפני זלוף FITC-dextran, שנערך 6 שעות, יום אחד, 3 ימים ו-7 ימים לאחר חשיפה ל-BSW. בפרוטוקול 'Pre', התמיסה הכחולה של אוונס הוזרקה מ...

Discussion

טכניקת תיוג כפולה חדשה באמצעות כחול אוונס ו-FITC-dextn שימשה כדי להמחיש במדויק את ההתפלגות המרחבית-זמנית המדויקת של פירוק BBB במוח יחיד. במודל BSW בעצימות נמוכה, נצפו שינויים ניכרים בהיקף, במיקום ובדרגת הוצאת הצבע במוחות שנבדקו (איור 2 ואיור 3). אי ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למאיומי וואטאנאבה על טכניקת ההקפאה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מתקדם ברפואה צבאית ממשרד ההגנה ביפן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Formalin Neutral Buffer SolutionFUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, RabbitDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, RabbitFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351tissue freezing medium
DomitorOrion Corporationmedetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/CaseCORNING351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)AGC TECHNO GLASS3910-03535 mm glass bottom dish
IX83 Inverted MicroscopeOLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope SlidesMatsunami GlassMAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mmMatsunami GlassC018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Peristaltic PumpATTOSJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX
Adult Mouse, 30 g, Coronal		ASI INSTRUMENTSRBM-2000Cbrain slicer
VetorphaleMeiji Animal HealthVETLI5butorphanol

References

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: From physiology to disease and back. Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Kabu, S., et al. Blast-associated shock waves result in increased brain vascular leakage and elevated ros levels in a rat model of traumatic brain injury. PLoS One. 10 (5), e0127971 (2015).
  3. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and spatial effects of blast overpressure on blood-brain barrier permeability in traumatic brain injury. Sci Rep. 8 (1), 8681 (2018).
  4. Yeoh, S., Bell, E. D., Monson, K. L. Distribution of blood-brain barrier disruption in primary blast injury. Ann Biomed Eng. 41 (10), 2206-2214 (2013).
  5. Readnower, R. D., et al. Increase in blood-brain barrier permeability, oxidative stress, and activated microglia in a rat model of blast-induced traumatic brain injury. J Neurosci Res. 88 (16), 3530-3539 (2010).
  6. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood-brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Front Cell Neurosci. 8, 232 (2014).
  7. Nishii, K., et al. Evans blue and fluorescein isothiocyanate-dextran double labeling reveals the precise sequence of vascular leakage and glial responses after exposure to mild-level blast-associated shock waves. J Neurotrauma. 40 (11-12), 1228-1242 (2023).
  8. Hoffmann, A., et al. High and low molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextrans to assess blood-brain barrier disruption: Technical considerations. Transl Stroke Res. 2 (1), 106-111 (2011).
  9. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Front Neurosci. 9, 385 (2015).
  10. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195 (2), 206-210 (2011).
  11. Yen, L. F., Wei, V. C., Kuo, E. Y., Lai, T. W. Distinct patterns of cerebral extravasation by Evans blue and sodium fluorescein in rats. PLoS One. 8 (7), e68595 (2013).
  12. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  13. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. 67, e2771 (2012).
  14. Satoh, Y., et al. Molecular hydrogen prevents social deficits and depression-like behaviors induced by low-intensity blast in mice. J Neuropathol Exp Neurol. 77 (9), 827-836 (2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564 (2012).
  16. Selever, J., Kong, J. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. 53, e2807 (2011).
  17. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  18. Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier. Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).
  19. Xu, Y., et al. Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran. J Neurosci Methods. 325, 108349 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved