Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Résumé

Une méthode a été mise au point pour visualiser l’extravasation du colorant due à la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) en administrant deux colorants fluorescents à des souris à différents moments dans le temps. L’utilisation du glycérol comme cryoprotecteur a facilité l’immunohistochimie sur le même échantillon.

Résumé

Les colorants fluorescents sont utilisés pour déterminer l’étendue de l’extravasation de colorant qui se produit en raison de la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le marquage avec ces colorants est un processus complexe influencé par plusieurs facteurs, tels que la concentration des colorants dans le sang, la perméabilité des vaisseaux cérébraux, la durée de l’extravasation du colorant et la réduction de la concentration du colorant dans les tissus en raison de la dégradation et de la diffusion. Dans un modèle de lésion cérébrale traumatique légère, l’exposition aux ondes de choc induites par l’explosion déclenche la dégradation de la BHE dans une fenêtre de temps limitée. Pour déterminer la séquence précise de la dégradation de la BHE, le bleu d’Evans et l’isothiocyanate-dextran de fluorescéine ont été injectés par voie intravasculaire et intracardiale à des souris à divers moments par rapport à l’exposition à l’BSW. La distribution de la fluorescence du colorant dans les tranches de cerveau a ensuite été enregistrée. Les différences de distribution et d’intensité entre les deux colorants ont révélé la séquence spatio-temporelle de la dégradation de la BHE. L’immunomarquage des tranches de cerveau a montré que les réponses astrocytaires et microgliales étaient corrélées avec les sites de dégradation de la BHE. Ce protocole a un large potentiel d’application dans des études impliquant différents modèles de dégradation de la BHE.

Introduction

La rupture et le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) sont causés par une inflammation systémique, des infections, des maladies auto-immunes, des blessures et des maladies neurodégénératives¹. Dans les lésions cérébrales traumatiques légères (TCLm) résultant d’une exposition à des ondes de choc induites par une explosion, une corrélation significative a été observée entre l’intensité des TCS et la quantité de fuite de colorant fluorescent due à la dégradation de la BHE ^2,3,4. Une caractéristique notable de la dégradation de la BHE dans le TCL est qu’elle commence immédiatement ou dans les heures qui suivent l’exposition aux TCS et qu’il s’agit généralement d’un processus transitoire qui dure environ une semaine avant l’apparition de troubles neurologiques chroniques retardés 3,5,6,7. Bien que les détails restent incertains, la dégradation de la BHE fait partie de la cascade pathologique de longue durée et peut également servir de facteur pronostique dans le TCL⁶. Par conséquent, il est important de comprendre les distributions spatiales et temporelles de la dégradation de la BHE dans le cerveau.

Des colorants fluorescents sont utilisés pour déterminer l’étendue de la dégradation de la BHE ^3,8. Étant donné que la concentration sanguine des colorants ainsi que l’ampleur et l’étendue de la dégradation de la BHE changent au fil du temps, il faut faire preuve de prudence lors de l’interprétation d’images d’extravasation de colorant. Par exemple, l’absence d’extravasation de colorant n’indique pas nécessairement l’absence de dégradation de la BHE. Aucune dégradation de la BHE ne peut être détectée avant ou après une augmentation de la concentration sanguine du colorant. Même si le colorant a réussi à s’accumuler là où la dégradation de la BHE s’est produite, il peut avoir été perdu au fil du temps après la fin de la décomposition. En général, les substances hydrosolubles et biologiquement inertes sont rapidement excrétées dans l’urine⁹. Par conséquent, pour déterminer si la dégradation de la BHE se produit à un moment précis, les résultats les plus fiables sont obtenus lorsqu’un colorant fluorescent est administré dans la circulation sanguine pendant une courte période immédiatement avant de fixer l’animal. L’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran disponible dans le commerce avec un poids moléculaire spécifique doit être utilisé de cette manière.

Le bleu d’Evans est un colorant azoïque bleu largement reconnu avec une forte affinité pour l’albumine sérique. Le colorant présente une fluorescence rouge lorsqu’il est excité par la lumière verte dans les systèmes biologiques². En raison de sa nature inerte, le complexe d’albumine sérique bleue d’Evans reste dans le sang jusqu’à 2 h, ce qui en fait un traceur utile de 69 kDa pour le marquage des régions avec une BHE compromise pendant au moins cette durée^10,11. Par conséquent, il est important de tenir compte des incertitudes potentielles entourant la pharmacocinétique et la toxicité d’Evans blue⁹. Cependant, une étude récente a montré que le bleu d’Evans continue de s’accumuler dans les zones où la BHE est absente ou perturbée⁷. Cette fonction a permis à Evans Blue d’enregistrer l’historique de la panne de la BROCHE, tandis que FITC-dextran a été utilisé pour enregistrer la panne de la BHE à un moment précis après l’exposition à la BSW. Bien qu’Evans blue puisse être administré par voie intraveineuse ou intrapéritonéale¹⁰, l’administration intraveineuse est préférée pour les expériences sensibles au temps. Cette étude visait à démontrer l’utilisation du bleu d’Evans et du FITC-dextran pour détecter la distribution spatio-temporelle de la dégradation de la BHE après une exposition à la BSW.

Deuxièmement, l’étude a présenté une technique pour congeler des tranches de cerveau après avoir observé la fluorescence de la dégradation de la BHE et préparé des tranches plus minces adaptées aux procédures immunohistochimiques. L’utilisation du glycérol comme milieu de montage et cryoprotecteur simplifie le processus d’immunohistochimie. En comparant les images de la dégradation de la BHE avec celles de l’immunohistochimie, la distribution spatio-temporelle de la dégradation de la BHE peut être corrélée avec la réponse tissulaire du même échantillon.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives éthiques pour les expériences sur les animaux établies par le National Defense Medical College (Tokorozawa, Japon). Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité de recherche animale du National Defense Medical College (approbation n° 23011-1). Des souris C57BL/6J mâles âgées de 8 semaines et pesant de 19 à 23 g ont été utilisées dans cette étude. Comme l’illustre la figure 1, une seule injection de bleu d’Evans et une perfusion de FITC-dextran ont été effectuées à divers moments en relation avec une seule exposition à l’ASB. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Anesthésie

REMARQUE : Il s’agit d’un protocole modifié qui augmente la quantité de médétomidine de 2,5 fois par rapport à l’original¹². Les doses de chlorhydrate de médétomidine, de midazolam et de butorphanol étaient respectivement de 0,75 mg/kg, 4 mg/kg et 5 mg/kg.

1. Préparez un mélange de chlorhydrate de médétomidine (75 μg/mL), de midazolam (400 μg/mL) et de butorphanol (500 μg/mL) dans une solution saline physiologique.
2. Administrer le mélange par voie intrapéritonéale pour anesthésier la souris (10 μL/g)¹³.
3. Après environ 5 à 10 minutes, vérifiez une anesthésie suffisante en observant l’absence de pincement de la queue et de réflexes de retrait de la pédale.
4. Gardez la souris au chaud jusqu’à ce qu’elle se remette des effets de l’anesthésie.

2. Exposition à l’ASB

REMARQUE : Un tube de choc interne a été utilisé dans cette étude¹⁴.

1. Anesthésie la souris comme décrit à l’étape 1.
2. Placez la souris à 5 cm de l’extrémité de sortie du tube d’amortisseur, en vous assurant que l’axe de son corps est parallèle à l’axe du tube, mais qu’il n’est pas aligné avec celui-ci.
3. Délivrer une seule exposition BSW avec une surpression maximale de 25 kPa à la tête.
   REMARQUE : Gardez la souris au chaud jusqu’à ce qu’elle se remette des effets de l’anesthésie. Surveillez régulièrement l’état de la souris traitée. Si des signes de détresse, tels que des difficultés à s’alimenter ou à boire, une courbure ou une apparence anormale prolongée sans signes de récupération, sont observés, euthanasier la souris et mettre fin à l’expérience plus tôt. Évitez d’administrer des analgésiques, car ils peuvent potentiellement affecter la réponse gliale.

3. Injection de bleu Evans dans la veine de la queue

REMARQUE : La solution bleue d’Evans doit être administrée par voie intraveineuse sans anesthésie. En présence d’une anesthésie, le colorant ne pénètre souvent pas suffisamment dans le corps, probablement en raison d’une diminution de la pression artérielle et de la température corporelle¹³. Evans blue a été administré à une dose de 100 mg / kg.

1. Préparez la solution bleue Evans (4 % p/v dans une solution saline) dans un microtube, puis vortex et stockez-la dans l’obscurité avant utilisation.
2. Injecter la solution dans la veine de la queue (2,5 μL/g)¹³.

4. Perfusion transcardique avec solution de FITC-dextran et fixation

1. Ajoutez de l’héparine à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une concentration de 1 U/mL, puis ajoutez du FITC-dextran au PBS hépariné pour obtenir une concentration de 3 mg/mL.
2. Dissoudre complètement la poudre FITC-dextran avant utilisation. Pour ce faire, agitez doucement la solution pendant 30 minutes ou plus. Avant utilisation, vérifiez soigneusement qu’il n’y a pas de poudre FITC-dextran non dissoute. S’il en reste, continuez à agiter jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
3. Anesthésie la souris comme décrit à l’étape 1.
4. Procéder avec le protocole standard de fixation de perfusion^à l’aide d’une pompe péristaltique ^15,16. Tout d’abord, perfuser avec du PBS hépariné contenant du FITC-dextran pendant 2 min à un débit de 4,0 mL/min. Ensuite, perfuser avec une solution tampon neutre de formol à 10 % ou de paraformaldéhyde-PBS à 4 % pendant 2 min à un débit de 4,0 mL/min, suivi de 8 min à un taux de 3,5 mL/min.
5. Retirez soigneusement le cerveau à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler^15,16. Après la dissection, post-fixer le cerveau pendant la nuit dans le même fixateur (c’est-à-dire une solution tampon neutre de formol à 10 % ou de paraformaldéhyde-PBS à 4 %) à 4 °C.
6. Le lendemain, remplacez le fixateur par du PBS.

5. Traitement des tissus cérébraux

REMARQUE : Même si la fixation de la perfusion est complète, le bleu Evans et le FITC-dextran peuvent se disperser dans le tampon. Par conséquent, les procédures menant à l’étape 6.8 doivent être terminées dans la semaine suivant la fixation de la perfusion. De plus, évitez d’exposer l’échantillon à la lumière.

1. Préparez une plaque de 24 puits avec 500 μL de glycérol à 20 % dans un tampon phosphate (PB ; pH 7,4) dans chaque puits.
2. À l’aide d’un coupe-cerveau, coupez le cerveau en 12 tranches de 1 mm d’épaisseur chacune.
3. Transférez chaque tranche dans le puits correspondant de la plaque à 24 puits et conservez-la à 4 °C pendant au moins 2 h.
4. Remplacez la solution par du glycérol-PB à 50 % et conservez-la à 4 °C pendant au moins 2 h.
5. Enfin, remplacez la solution par du glycérol à 100 %. Pour une observation microscopique immédiate, laissez reposer les tranches pendant au moins 2 h à température ambiante ou conservez-les à 4 °C. Les tranches seront maintenant translucides et prêtes pour l’observation microscopique.

6. Mesure de fluorescence de l’extravasation du colorant

REMARQUE : L’efficacité du marquage par fluorescence varie d’une souris à l’autre. Par conséquent, l’intensité de la fluorescence doit être normalisée. Les valeurs de fluorescence sont exprimées par rapport à celles du noyau réticulaire gigantocellulaire (GRN), car cette région est peu affectée par le traitement par BSW.

1. Ajoutez 500 μL de glycérol au fond d’un plat à fond de verre de 35 mm.
2. Transférez la tranche dans la solution de glycérol et couvrez sa surface avec un couvre-verre.
3. Retirez l’excès de glycérol du bord du couvre-glace.
4. Mesurez l’intensité de fluorescence de la tranche à l’aide d’un microscope à fluorescence.
5. Après la mesure microscopique, remettez la tranche dans le puits.
6. Répétez la mesure pour les 12 tranches.
7. Ajouter 500 μL de PB dans chaque puits et conserver la plaque à 24 puits à 4 °C pendant la nuit ; le lendemain, les tranches seront saturées de 50 % de glycérol-PB.
8. Remplacer la solution par du glycérol-PB à 30 % et la conserver à 4 °C pendant au moins 2 h.
9. Effectuez les procédures de l’étape 7 en quelques semaines.

7. Cryosectionnement et immunohistochimie

1. Préparez une plaque à 24 puits en ajoutant 1000 μL d’un mélange de volumes égaux de milieu de congélation tissulaire et de 30 % de glycérol-PB au puits 1. Ensuite, ajoutez 1000 μL de fluide de congélation de tissu au puits 2.
2. Transférez la tranche dans le puits 1 et secouez l’assiette à 4 °C pendant 1 h.
3. Transférez la tranche dans le puits 2 et secouez la plaque à 4 °C pendant 1 h.
4. Congelez rapidement la tranche avec de l’isopentane à l’aide de glace sèche en prenant soin de ne pas plier la tranche. Conservez les tranches à -80 °C jusqu’à la cryosection.
5. Cryosection de la tranche à une épaisseur de 6 μm. Après séchage sur la lame de microscope, stockez les coupes à -80 °C.
6. Pour le prélèvement d’antigène¹⁷, immerger les sections dans 10 mM de citrate de sodium (pH 6,0), chauffer une fois à 100 °C, puis maintenir à 98 °C pendant 1 h.
7. Lavez abondamment les sections à l’eau distillée. Les coupes sont maintenant prêtes pour la coloration immunohistochimique.

Résultats

La figure 1A montre l’évolution temporelle de l’injection du colorant par rapport au début de l’injection de colorant, avec un pic de surpression de 25 kPa. Dans le protocole « Post », la solution bleue d’Evans a été administrée par voie intravasculaire 2 h avant la perfusion FITC-dextran, qui a été réalisée 6 h, 1 jour, 3 jours et 7 jours après l’exposition à l’BSW. Dans le protocole « Pré », la solution bleue d’Evans a été i...

Discussion

Une nouvelle technique de double marquage utilisant le bleu d’Evans et le FITC-dextran a été utilisée pour visualiser avec précision la distribution spatio-temporelle précise de la dégradation de la BHE dans un seul cerveau. Dans le modèle de BSW de faible intensité, des variations notables dans l’étendue, l’emplacement et le degré d’extravasation du colorant ont été observées dans les cerveaux examinés (figure 2 et

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol