軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

要約

血液脳関門(BBB)の破壊による色素の血管外漏出を可視化する方法として、異なる時点のマウスに2種類の蛍光色素を投与することで可視化する方法を開発しました。グリセロールを凍結保護剤として使用すると、同じサンプルでの免疫組織化学が促進されました。

要約

蛍光色素は、血液脳関門(BBB)の破壊によって発生する色素の血管外漏出の程度を決定するために使用されます。これらの色素による標識は、血液中の色素の濃度、脳血管の透過性、色素の血管外漏出の持続時間、劣化と拡散による組織内の色素濃度の低下など、いくつかの要因の影響を受ける複雑なプロセスです。軽度の外傷性脳損傷モデルでは、爆風誘発衝撃波(BSW)への曝露は、限られた時間枠内でBBBの破壊を引き起こします。BBBブレークダウンの正確な配列を決定するために、エバンスブルーとフルオレセインイソチオシアネート-デキストランを、BSW曝露に関連するさまざまな時点でマウスに血管内および心内に注射しました。次に、脳スライス中の色素蛍光の分布を記録しました。2つの色素間の分布と強度の違いにより、BBBブレークダウンの時空間配列が明らかになりました。脳切片の免疫染色により、アストロサイトおよびミクログリアの応答がBBB分解部位と相関していることが示されました。このプロトコルは、さまざまな BBB ブレークダウンモデルを含む研究に幅広く適用できる可能性を秘めています。

概要

血液脳関門(BBB)の破壊と機能障害は、全身性炎症、感染症、自己免疫疾患、傷害、神経変性疾患によって引き起こされます¹。爆風衝撃波(BSW)への曝露に起因する軽度の外傷性脳損傷(mTBI)では、BSWの強度とBBB^の分解による蛍光色素の漏出量との間に有意な相関が観察されています^2,3,4。mTBIにおけるBBBの分解の注目すべき特徴の1つは、BSWへの曝露後すぐにまたは数時間以内に始まり、通常は遅延性の慢性神経障害が現れる前に約1週間続く一時的なプロセスであることです3,5,6,7。詳細は不明のままですが、BBB の分解は長期にわたる病理学的カスケードの一部であり、mTBI⁶ の予後因子としても役立つ可能性があります。したがって、脳内のBBB分解の空間的および時間的分布を理解することが重要です。

蛍光色素は、BBBの分解の程度を決定するために使用されます^3,8。色素の血中濃度とBBB分解の程度は時間とともに変化するため、色素の血管外漏出の画像を解釈する際には注意が必要です。例えば、色素の血管外漏出がないからといって、必ずしもBBBの分解がないわけではありません。染料の血中濃度が上昇する前または後にBBBの分解が検出されない場合があります。.BBBの分解が発生した場所で色素が正常に蓄積したとしても、分解が止まった後に時間の経過とともに色素が失われている可能性があります。一般に、水溶性で生物学的に不活性な物質は、尿中にすぐに排泄されます⁹。したがって、BBBの分解が特定の時間に起こるかどうかを判断するためには、動物を固定する直前に蛍光色素を短時間血流に投与した場合に最も信頼性の高い結果が得られます。この方法では、特定の分子量を持つ市販のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを使用する必要があります。.

エバンスブルーは、血清アルブミンに強い親和性を持つ広く認知されている青色のアゾ染料です。この色素は、^{生体システム2}において緑色光によって励起されると赤色の蛍光を示す。その不活性な性質により、エバンスブルー-血清アルブミン複合体は最大2時間血液中に留まり、少なくともこの期間^10,11でBBBが損なわれた領域を標識するための有用な69kDaトレーサーになります。したがって、Evans blue⁹の薬物動態と毒性を取り巻く潜在的な不確実性を考慮することが重要です。しかし、最近の研究では、エバンスブルーはBBBが存在しないか、または乱れている領域に蓄積し続けることが示されました⁷。この機能により、Evans BlueはBBBの内訳の履歴を記録することができ、FITC-dextranはBSW曝露後の特定の時点でのBBBの内訳を記録するために使用されました。Evans blueは静脈内投与または腹腔内投与が可能です^が10、時間的制約のある実験には静脈内投与が好ましい。この研究は、BSW への曝露後の BBB ブレークダウンの時空間分布を検出するために、Evans blue と FITC-dextran の使用を実証することを目的としています。

次に、この研究では、BBBブレークダウンの蛍光を観察した後、脳スライスを凍結し、免疫組織化学的手順に適した薄いスライスを調製する技術が提示されました。グリセロールを封入剤および凍結保護剤として使用すると、免疫組織化学プロセスが簡素化されます。BBBの分解の画像を免疫組織化学の画像と比較することにより、BBBの分解の時空間分布を同じサンプルの組織応答と相関させることができます。

プロトコル

すべての実験は、防衛医科大学(所沢市)が定めた動物実験に関する倫理指針に則って行われました。この研究プロトコルは、国防医科大学の動物研究委員会によって承認されました(承認番号23011-1)。この研究では、8週齢、体重19〜23 gの雄C57BL / 6Jマウスを使用しました。 図1に示すように、1回のBSW曝露に関連して、1回のEvansブルー注射とFITC-デキストラン灌流をさまざまな時点で実施しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1.麻酔

注:これは、元のものと比較してメデトミジンの量を2.5倍に増加させる修正されたプロトコル^です12。メデトミジン塩酸塩、ミダゾラム、ブトルファノールの投与量は、それぞれ0.75 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kgでした。

1. 塩酸メデトミジン(75 μg/mL)、ミダゾラム(400 μg/mL)、ブトルファノール(500 μg/mL)を生理食塩水に混合して調製します。
2. 混合物を腹腔内に投与して、マウスに麻酔をかけます(10μL / g)¹³。
3. 約5〜10分後、テールピンチとペダル離脱反射の欠如を観察して、十分な麻酔を確認します。
4. 麻酔の影響から回復するまで、マウスを暖かく保ちます。

2.BSW曝露

注:この研究では、社内のショックチューブが使用されました¹⁴。

1. ステップ1の説明に従ってマウスに麻酔をかけます。
2. マウスをショックチューブの出口端から5cm離して配置し、本体の軸がチューブの軸と平行であるが、位置が合っていないことを確認します。
3. ピーク過圧25kPaで頭部に1回のBSW露光を行います。
   注意: 麻酔の影響から回復するまで、マウスを暖かく保ちます。治療したマウスの状態を定期的に監視します。摂食や飲酒の困難、猫背、回復の兆候がない長時間の異常な外観などの苦痛の兆候が観察された場合は、マウスを安楽死させ、実験を早期に終了してください。鎮痛薬の投与は、グリア反応に影響を与える可能性があるため、避けてください。.

3.尾静脈へのエバンスブルー注射

注:エバンスブルー溶液は麻酔なしで静脈内投与する必要があります。.麻酔の存在下では、染料はしばしば体に十分に浸透しませんが、これはおそらく血圧と体温の低下によるものです¹³。エバンスブルーは100 mg / kgの用量で投与されました。.

1. エバンスブルー溶液(生理食塩水中4%w / v)をマイクロチューブに調製し、ボルテックスして暗闇で保管してから使用してください。
2. 溶液を尾静脈(2.5μL / g)に注入します¹³。

4. FITC-デキストラン溶液による経心灌流と固定

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にヘパリンを添加して1 U/mLの濃度にした後、ヘパリン化したPBSにFITC-デキストランを添加して3 mg/mLの濃度にします。
2. 使用前にFITCデキストランパウダーを完全に溶解してください。これを行うには、溶液を30分以上静かに振ってください。使用前に、未溶解のFITCデキストラン粉末がないか注意深く確認してください。残っている場合は、完全に溶けるまで振とうを続けます。
3. ステップ1の説明に従ってマウスに麻酔をかけます。
4. 蠕動ポンプ^15,16を用いて標準的な灌流固定プロトコルを進める。まず、FITC-デキストランを含むヘパリン化PBSを4.0 mL/minの速度で2分間灌流します。次に、10%ホルマリン中性緩衝液または4%パラホルムアルデヒド-PBSで4.0 mL/minの速度で2分間灌流し、続いて3.5 mL/minの速度で8分間灌流します。
5. 手術用ハサミとピンセット^15,16を使用して脳を慎重に取り除きます。解剖後、同じ固定剤(すなわち、10%ホルマリン中性緩衝液または4%パラホルムアルデヒド-PBS)で脳を4°Cで一晩後固定します。
6. 翌日、固定剤をPBSに交換します。

5. 脳組織処理

注:灌流固定が完了していても、エバンスブルーとFITC-デキストランは緩衝液に分散する可能性があります。.したがって、ステップ6.8に至るまでの手順は、灌流固定後1週間以内に完了する必要があります。.また、サンプルを光にさらさないでください。

1. 各ウェルに500 μLの20%グリセロールをリン酸緩衝液(PB;pH 7.4)溶かした24ウェルプレートを調製します。
2. ブレインスライサーを使用して、脳を冠状に12スライスに切り、それぞれ1mmの厚さにします。
3. 各スライスを24ウェルプレートの対応するウェルに移し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
4. 溶液を50%グリセロール-PBと交換し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
5. 最後に、溶液を100%グリセロールに置き換えます。顕微鏡ですぐに観察するには、スライスを室温で少なくとも2時間放置するか、4°Cで保存します。 これで、スライスは半透明になり、顕微鏡観察の準備が整います。

6. 色素の血管外漏出の蛍光測定

注:蛍光標識効率はマウスによって異なります。したがって、蛍光強度を正規化する必要があります。蛍光値は、巨大細胞網様体核(GRN)内の値と比較して相対的に表されます。これは、この領域がBSW処理の影響を最小限にするためです。

1. 35 mmガラス底皿の底に500 μLのグリセロールを加えます。
2. スライスをグリセロール溶液に移し、その表面をカバーガラスで覆います。
3. カバーガラスの端から余分なグリセリンを取り除きます。
4. 蛍光顕微鏡でスライスの蛍光強度を測定します。
5. 顕微鏡での測定後、スライスをウェルに戻します。
6. 12個のスライスすべてについて測定を繰り返します。
7. 各ウェルに500 μLのPBを加え、24ウェルプレートを4°Cで一晩保存します。翌日、スライスは50%グリセロール-PBで飽和されます。
8. 溶液を30%グリセロール-PBと交換し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
9. ステップ 7 の手順を数週間以内に実行します。

7. 凍結切片と免疫組織化学

1. 等量の組織凍結培地と30%グリセロール-PBの混合物1000 μLをウェル1に加えて、24ウェルプレートを調製します。次に、1000 μLの組織凍結培地をウェル2に加えます。
2. スライスをウェル1に移し、プレートを4°Cで1時間振とうします。
3. スライスをウェル2に移し、プレートを4°Cで1時間振とうします。
4. スライスを曲げないように注意しながら、ドライアイスを使用してイソペンタンでスライスをすばやく凍結します。スライスを凍結切片になるまで-80°Cで保存します。
5. スライスを6μmの厚さに凍結切片します。顕微鏡スライドで乾燥させた後、切片を-80°Cで保存します。
6. 抗原賦活化¹⁷では、切片を10 mMクエン酸ナトリウム(pH 6.0)に浸し、一度100°Cに加熱した後、98°Cで1時間維持します。
7. 切片を蒸留水で広範囲に洗浄します。これで、切片は免疫組織化学染色の準備が整いました。

結果

図1A は、BSWの発症に対する色素注入の時間経過を示しており、ピーク過圧は25 kPaです。「ポスト」プロトコルでは、エバンスブルー溶液をFITC-デキストラン灌流の2時間前に血管内投与し、BSW曝露の6時間後、1日後、3日後、および7日後に実施しました。「Pre」プロトコルでは、Evansブルー溶液をBSW曝露の直前に注入しました。「Post」プロトコル?...

ディスカッション

エバンスブルーとFITC-デキストランを用いた新しい二重標識技術を用いて、単一の脳におけるBBBブレークダウンの正確な時空間分布を正確に可視化しました。低強度BSWモデルでは、検査した脳で色素の血管外漏出の程度、位置、および程度に顕著な変動が観察されました(図2 および 図3)。色素間のミスマッチにより、BBBの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol