تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

Summary

يحدد هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالفصل السريع لعينات ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

Abstract

تحتوي عينات الأورام البشرية على عدد كبير من المعلومات حول بيئتها المكروية وذخيرتها المناعية. يعد التفكك الفعال لعينات الأنسجة البشرية إلى معلقات خلوية قابلة للحياة مدخلا مطلوبا لخط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq). على عكس أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يمكننا scRNAseq من استنتاج عدم تجانس النسخ في عينات الورم على مستوى الخلية الواحدة. أدى دمج هذا النهج في السنوات الأخيرة إلى العديد من الاكتشافات ، مثل تحديد الحالات الخلوية المناعية والأورام والبرامج المرتبطة بالاستجابات السريرية للعلاجات المناعية وأنواع أخرى من العلاجات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات الخلية الواحدة المطبقة على الأنسجة المنفصلة لتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ذخيرة مستقبلات الخلايا T و B ، والتعبير عن البروتينات ، باستخدام الأجسام المضادة المشفرة بالحمض النووي (CITEseq).

تعد صلاحية وجودة العينة المنفصلة متغيرات حرجة عند استخدام هذه التقنيات ، حيث يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التلوث المتبادل للخلايا المفردة بالحمض النووي الريبي المحيط ، وجودة البيانات ، والتفسير. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات التفكك الطويلة إلى القضاء على مجموعات الخلايا الحساسة وتنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد. للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا بروتوكول تفكك عالمي سريع ، والذي تم التحقق من صحته على أنواع متعددة من أورام الإنسان والفئران. تبدأ العملية بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي ، يليه الترشيح ، وتحلل الدم الأحمر ، والتخصيب الحي الميت ، وهو مناسب للعينات ذات المدخلات المنخفضة من الخلايا (على سبيل المثال ، خزعات لب الإبرة). يضمن هذا البروتوكول تعليقا نظيفا وقابلا للحياة أحادي الخلية له أهمية قصوى للجيل الناجح من مستحلبات حبيبات الجل (GEMs) ، والترميز الشريطي ، والتسلسل.

Introduction

على الرغم من أن العديد من التطورات في أبحاث السرطان قد أدت إلى تطوير وموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على العوامل التي تستهدف المستقبلات المثبطة المعبر عنها على الخلايا المناعية والسرطانية ، والمعروفة باسم مثبطات حصار نقاط التفتيش ، إلا أن مقاومة العلاج وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المريض لا تزال صعبة¹. إن التحدي المعقد المتمثل في توصيف عدم تجانس الورم على تنوعه الجزيئي والتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية المناعية يتطلب أساليب جديدة لتشريح هذا النظام البيئي المعقد بدقة الخلية الواحدة. يعد فهم التعقيدات الجزيئية داخل الأورام وبيئاتها الدقيقة أمرا محوريا لتطوير الاستراتيجيات العلاجية وفك رموز البيولوجيا المعقدة الكامن....

Protocol

امتثلت هذه الدراسة لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بأخذ عينات الأنسجة البشرية. تم تلقي الموافقة المستنيرة من المرضى ، وتم إخفاء هوية بيانات العينة التي يمكن التعرف عليها. يتم جمع العينات في غرفة العمليات ، ووضعها في محلول RPMI أو محلول ملحي أو PBS ، وتأكيد إصابتها بالسرطان عبر قسم علم الأمراض قبل استخدامها في البحث. يجب تنفيذ جميع الخطوات ، باستثناء ما يشير إليه ، عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. العمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند معالجة الأنسجة البشرية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. الحصول على العينة

1. احصل على عينة و....

النتائج

تم الحصول على خزعة سرطان الجلد المعلقة في RPMI ووضعها على الفور على الجليد. تم نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 420 ميكرولتر من RPMI وإنزيمات الهضم ، وتم فرمها إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ، وخضعت للهضم الأنزيمي اللاحق لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري رأسيا 37 درجة مئوية (?.......

Discussion

يصف هذا البروتوكول تفكك عينات ورم الإنسان أو الفئران إلى تعليق خلية واحدة لتسلسل scRNA باستخدام نظام الموائع الدقيقة 10x Genomics. عند معالجة الأنسجة التي غالبا ما تأتي من سرطانات نادرة أو تشكل جزءا من التجارب السريرية الجارية أو التجارب الطويلة لأورام الفئران ، يجب الحفاظ على العينة على النحو ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C