تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

Summary

يحدد هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالفصل السريع لعينات ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

Abstract

تحتوي عينات الأورام البشرية على عدد كبير من المعلومات حول بيئتها المكروية وذخيرتها المناعية. يعد التفكك الفعال لعينات الأنسجة البشرية إلى معلقات خلوية قابلة للحياة مدخلا مطلوبا لخط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq). على عكس أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يمكننا scRNAseq من استنتاج عدم تجانس النسخ في عينات الورم على مستوى الخلية الواحدة. أدى دمج هذا النهج في السنوات الأخيرة إلى العديد من الاكتشافات ، مثل تحديد الحالات الخلوية المناعية والأورام والبرامج المرتبطة بالاستجابات السريرية للعلاجات المناعية وأنواع أخرى من العلاجات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات الخلية الواحدة المطبقة على الأنسجة المنفصلة لتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ذخيرة مستقبلات الخلايا T و B ، والتعبير عن البروتينات ، باستخدام الأجسام المضادة المشفرة بالحمض النووي (CITEseq).

تعد صلاحية وجودة العينة المنفصلة متغيرات حرجة عند استخدام هذه التقنيات ، حيث يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التلوث المتبادل للخلايا المفردة بالحمض النووي الريبي المحيط ، وجودة البيانات ، والتفسير. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات التفكك الطويلة إلى القضاء على مجموعات الخلايا الحساسة وتنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد. للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا بروتوكول تفكك عالمي سريع ، والذي تم التحقق من صحته على أنواع متعددة من أورام الإنسان والفئران. تبدأ العملية بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي ، يليه الترشيح ، وتحلل الدم الأحمر ، والتخصيب الحي الميت ، وهو مناسب للعينات ذات المدخلات المنخفضة من الخلايا (على سبيل المثال ، خزعات لب الإبرة). يضمن هذا البروتوكول تعليقا نظيفا وقابلا للحياة أحادي الخلية له أهمية قصوى للجيل الناجح من مستحلبات حبيبات الجل (GEMs) ، والترميز الشريطي ، والتسلسل.

Introduction

على الرغم من أن العديد من التطورات في أبحاث السرطان قد أدت إلى تطوير وموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على العوامل التي تستهدف المستقبلات المثبطة المعبر عنها على الخلايا المناعية والسرطانية ، والمعروفة باسم مثبطات حصار نقاط التفتيش ، إلا أن مقاومة العلاج وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المريض لا تزال صعبة¹. إن التحدي المعقد المتمثل في توصيف عدم تجانس الورم على تنوعه الجزيئي والتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية المناعية يتطلب أساليب جديدة لتشريح هذا النظام البيئي المعقد بدقة الخلية الواحدة. يعد فهم التعقيدات الجزيئية داخل الأورام وبيئاتها الدقيقة أمرا محوريا لتطوير الاستراتيجيات العلاجية وفك رموز البيولوجيا المعقدة الكامنة وراء تطور السرطان². أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) شائعا بشكل متزايد لأنه يوفر تحليلا عالي الدقة للخلايا الفردية داخل عينات الورم المعقدة ^3,4.

يشكل عدم تجانس الورم ، الذي يشمل التنوع الجيني والجيني والظاهري ، تحديا في الكشف عن تعقيدات بيولوجيا السرطان⁵. تميل الطرق التقليدية لتسلسل الحمض النووي الريبي المجمع إلى إخفاء ملامح التعبير الفريدة والأنماط الظاهرية لمجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة داخل الأورام ، حيث تقوم هذه الطرق بمتوسط الإشارات عبر مجموعات الخلايا بأكملها⁴. في المقابل ، يسمح scRNA-seq بتشريح أنواع الخلايا الفردية ، والكشف عن التعبير الجيني المتنوع ، وأنماط القمع ، والحالات الخلوية التي يتم تجاهلها^{بخلاف ذلك 4,6}. تكمن فرضية scRNA-seq في قدرته على فك تشفير التوقيعات الجينية والجزيئية للخلايا الفردية ، مما يحمل وعدا هائلا في اكتشاف علاجات جديدة للسرطان⁷.

من خلال فك رموز ملامح التعبير الجيني للخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والمناعية المحيطة ، يمكن للباحثين تحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير استراتيجيات الطب الوراثي الدقيقة المصممة خصيصا للمرضى^{الفرديين 6}. علاوة على ذلك ، فإن تشريح الذخيرة المناعية داخل البيئة المكروية للورم يوفر رؤى حاسمة في التفاعل بين الخلايا السرطانية والمستجيبات المناعية ، مما يمهد الطريق للتدخلات العلاجية المناعية³. على الرغم من التقدم في استخدام scRNAseq على العينات السريرية ، فإن العديد من التحديات أثناء خطوات المعالجة يمكن أن تضر بسلامة الحمض النووي الريبي للخلية وصلاحيتها وجودة البيانات التي تم إنشاؤها. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي معالجة الأنسجة ذات الصلاحية المنخفضة للخلية إلى زيادة مستويات الحمض النووي الريبي المحيط في القطرات المتولدة أثناء تغليف الخلايا الفردية ، مما يؤدي إلى التلوث المتبادل والتعليق غير الصحيح لأنواع الخلايا ، في حين أن بروتوكولات التفكك الطويلة التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية يمكن أن تؤدي إلى زيادة تنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد في أنواع متعددة من الخلايا ^{8,9 ، 10}.

يبدأ الإجراء التدريجي (الشكل 1 أ) الموضح في هذا البروتوكول بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي السريع للأورام ، يليه الترشيح وإزالة الخلايا الميتة ، اعتمادا على صلاحية كل عينة ورم. في الوقت الحاضر ، تم التحقق من هذا الإجراء في سرطان الجلد¹¹ ، القولون والمستقيم¹² ، سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة¹³ ، عينات ورم البنكرياس والرئة (بيانات غير منشورة). تضمن هذه التقنيات توليد معلقات خلوية قابلة للحياة عالية الجودة ضرورية للتحليلات النهائية¹⁴. والجدير بالذكر أن إزالة خلايا الدم الحمراء ، الخالية من الحمض النووي الريبي المركب ، تصبح ضرورية لتنقية العينة¹⁵. يعمل التقييم اللاحق لعدد الخلايا والقضاء على الخلايا الميتة كشرط أساسي لنجاح توليد مستحلب حبة الجل 10x Genomics (GEM) ، والترميز الشريطي ، وزيادة استعادة النصوص والخلايا المتسلسلة دون تعريض استبعاد المجموعات السكانية الحساسة للخطر (على سبيل المثال ، العدلات والخلايا الظهارية)¹⁶. هذه الخطوات أساسية في إطلاق العنان لإمكانات تحليل دقة الخلية الواحدة داخل عينات الورم ^9,10 ، والكشف عن ملفات تعريف التعبير الجيني الجديدة والتوقيعات المناعية اللازمة لدفع التدخلات العلاجية المبتكرة ، وتحديد نقاط الضعف الجديدة للورم.

Protocol

امتثلت هذه الدراسة لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بأخذ عينات الأنسجة البشرية. تم تلقي الموافقة المستنيرة من المرضى ، وتم إخفاء هوية بيانات العينة التي يمكن التعرف عليها. يتم جمع العينات في غرفة العمليات ، ووضعها في محلول RPMI أو محلول ملحي أو PBS ، وتأكيد إصابتها بالسرطان عبر قسم علم الأمراض قبل استخدامها في البحث. يجب تنفيذ جميع الخطوات ، باستثناء ما يشير إليه ، عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. العمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند معالجة الأنسجة البشرية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. الحصول على العينة

1. احصل على عينة ورم صلبة في أنبوب من الوسائط وضعها على الثلج.
   1. اطلب من موظفي غرفة العمليات نقل العينة في أنبوب يحتوي على ما يكفي من RPMI أو محلول ملحي أو برنامج تلفزيوني لغمر الأنسجة تماما لتجنب جفاف العينة.
      ملاحظة: من المهم التأكد من عدم تجفيف العينة ، لأن ذلك سيقلل من صلاحيتها.
2. قم بتبريد جميع أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية وجلب الخلاط الحراري إلى 37 درجة مئوية.
3. أخرج إنزيمات تفكك الورم البشري أو الفأر المحضرة (جدول المواد) ، وقم بإذابة الجليد على الخلاط الحراري 37 درجة مئوية ، وانتقل إلى الجليد بمجرد إذابته.
4. استرجع حصة 20 مل من RPMI.
5. سجل معلومات العينة ذات الصلة (على سبيل المثال ، معرف المريض ، إلغاء التعريف ، نوع العينة).
6. انقل العينة إلى طبق زراعة الأنسجة 60 مم (يوضع على الثلج) عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات وصب المحتويات في الطبق لضمان نقل جميع مواد العينة. إذا لم يتم تسليم العينة في الوسائط عند الوصول ، أضف وسائط RPMI جديدة إلى الطبق.
   1. إذا كانت العينة مجزأة ، فقم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق العينة في 420 ميكرولتر من RPMI ، وانتقل إلى القسم 2.

2. الهضم الميكانيكي والأنزيمي

1. ماصة 420 ميكرولتر من الوسائط من طبق العينة 60 مم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. حاول تضمين أي أجزاء عينة معلقة في الوسائط.
2. انقل عينة الأنسجة من طبق 60 مم إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على وسائط باستخدام الملقط. قم بتقطيع العينة بمقص نظيف داخل الأنبوب بحيث يبلغ قطر القطع 2-3 مم كحد أقصى.
3. أضف إنزيمات الهضم ، المحضرة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (جدول المواد) ، إلى العينة في الأحجام التالية: 42 ميكرولتر من الإنزيم H (البروتياز غير المحدد) للعينات البشرية ، الإنزيم D (البروتياز غير المحدد) لعينات الفئران ، 21 ميكرولتر من الإنزيم R (البروتياز غير المحدد) ، و 5 ميكرولتر من الإنزيم A (نوكلياز).
4. أضف 420 ميكرولتر أخرى من الوسائط من الطبق أو حتى علامة 1 مل على الأنبوب. لا تتجاوز 420 ميكرولتر من الوسائط.
5. دوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان ووضعه في خلاط حراري موضوع عموديا على جانبه (الشكل 1 ب). احتضان في 37 درجة مئوية ، 450 دورة في الدقيقة ، لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: أثناء الحضانة ، أخرج جميع مواد الجينوم 10x اللازمة لتوليد GEM ، لأنها تتطلب 30 دقيقة للتوازن مع درجة حرارة الغرفة

3. تصفية العينة

1. ضع مرشح خلية 50 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وقم بتجهيز المرشح عن طريق تمرير 1 مل من وسائط RPMI الجديدة من خلاله إلى الأنبوب.
2. بعد الهضم ، انقل العينة إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة عريض منخفض الاحتفاظ به 1000 ميكرولتر. اغسل الأنبوب سعة 1.5 مل ب 1 مل من الوسائط الطازجة وانقل الوسائط إلى المرشح لضمان تمرير جميع مواد العينة عبر الفلتر.
3. احصل على حقنة بلاستيكية سعة 1 مل وأخرج المكبس فقط (تخلص من باقي المحقنة). باستخدام الجزء الخلفي من مكبس المحقنة ، قم بطحن ودفع العينة على المرشح بحركة ملتوية.
4. اغسل المرشح ب 5 مل من الوسائط وأي وسائط متبقية من الطبق الذي يحتوي على العينة (القسم 1) لجمع أي خلايا قد تكون انفصلت عن الأنسجة.
5. ضع مرشح خلية 30 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل ، وقم بتجهيز المرشح ب 1 مل من الوسائط ، وانقل محتويات الأنبوب الذي يحتوي على العينة المنفصلة عبر المرشح.
   ملاحظة: ستزيل هذه الخطوة الحطام الكبير الذي قد يسد أو يتسبب في فشل الترطيب عند تشغيل العينة باستخدام رقائق الموائع الدقيقة 10x Genomics.

4. تحلل خلايا الدم الحمراء

1. أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وسائل الإعلام ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
2. أعد التعليق في المخزن المؤقت ACK Lysis لإزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وتسجيل الحجم المستخدم. يعتمد الحجم على حجم الحبيبات ومدى كرات الدم الحمراء في الحبيبات.
   ملاحظة: يجب أن يكون محلول عينة ACK المعاد تعليقه عديم اللون عند إضافة ما يكفي من محلول ACK Lysis ، حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة خلايا الدم الحمراء من العينة.
3. قم بطرد أنبوب العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية.
4. كرر الخطوات 4.2-4.3 حسب الحاجة حتى لا يكون لحبيبات العينة لون أحمر مرئي بعد الطرد المركزي (الشكل 2). سجل أي وحدات تخزين إضافية من المخزن المؤقت ACK Lysis المستخدم في هذه الخطوة.
5. أعد تعليق عينة الحبيبات في وسائط جديدة استعدادا للعد.

5. عد الخلايا

1. ضع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق في أنبوب سعة 1.5 مل. امزج الخلايا المنفصلة برفق ، وخذ 10 ميكرولتر من العينة ، واخلطها (1: 1) مع التريبان الأزرق. تحميل 10 ميكرولتر على كل جانب من مقياس الدم وعد الخلايا.
2. سجل تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا الحية ونسبة الصلاحية وحجم الوسائط النهائي بعد العدد.
3. تأكد من أن عدد الخلايا يتراوح بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر (7 × 10⁵- 1.2 × 10⁶ / مل) لتشغيل الجينوم 10x الأمثل.
   1. إذا كانت العينة مركزة للغاية ، فقم بتخفيفها بالوسائط وأعد فرزها.
   2. إذا كانت العينة مخففة جدا ، فقم بطرد العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في حجم أقل من الوسائط.
   3. إذا كانت صلاحية الخلية أقل من 80٪ ، فقم بإجراء حي ميت لإزالة الخلايا الميتة.
   4. إذا كان هناك أقل من مليون خلية ، انظر القسم 6.
   5. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء > 10٪ ، انظر القسم 6.
   6. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء < 10٪ ، انظر القسم 7.
   7. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

6. إزالة الخلايا الميتة - كيت 1

ملاحظة: اعمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند استخدام كواشف إزالة الخلايا الميتة ، حيث يمكن أن تتلوث بسهولة.

1. أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
2. قم بإعداد وسائط العزل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة: 9.8 مل من PBS ، و 10 ميكرولتر من CaCl₂ ، و 200 ميكرولتر من FCS المعطل بالحرارة (يضاف في غطاء السلامة البيولوجية).
3. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسائط من الحبيبات وأعد تعليقها في 1 مل من وسائط العزل.
4. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 450 × غرام ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسائط العزل.
5. نقل 100 ميكرولتر من العينة في وسائط العزل إلى بئر واحد من أنبوب شريط PCR سعة 0.2 مل.
6. في غطاء السلامة الأحيائية ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل Annexin V و 10 ميكرولتر من كوكتيل اختيار البيوتين إلى البئر الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من العينة في وسط العزل. ماصة خلط الحل والسماح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
7. بعد 4 دقائق ، دوامة الجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران لمدة 30 ثانية. أضف 20 ميكرولتر من الخرز و 60 ميكرولتر من وسائط العزل إلى العينة (حجم إجمالي 200 ميكرولتر). إذا كانت الصلاحية أقل من 40٪ ، فقم بقياس كمية الخرز حتى 40 ميكرولتر أثناء ضبط حجم وسائط العزل (حتى 40 ميكرولتر) ، مع الحفاظ على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر. مزيج ماصة والسماح للحل بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
8. ضع الأنبوب الشريطي على فاصل مغناطيسي 10x Genomics (على الإعداد العالي) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. انقل السائل من الأنبوب الشريطي دون إزعاج الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل من الربط. لا تقم بإزالة الأنبوب الشريطي من المغناطيس.
10. جهاز طرد مركزي أنبوب 1.5 مل يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وخلايا العد, كما هو موضح في القسم 5. كرر إجراء إزالة الخلايا الميتة إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ (الشكل 3 والشكل 4).
    ملاحظة: لا تقم بإعادة تعليق الخلايا في وسائط العزل لتوليد GEM النهائي ، لأن كلوريد الكالسيوم سيتداخل مع عملية التغليف وخطوة النسخ العكسي (RT).
11. احتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. إزالة الخلايا الميتة - كيت 2

ملاحظة: اعمل داخل غطاء للسلامة البيولوجية عند استخدام كواشف المجموعة.

1. ضع الميكروبيدات ومحلول مخزون 20x Binding Buffer داخل غطاء السلامة البيولوجية.
2. جهاز طرد مركزي تعليق العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بإعداد محلول عازل واحد × في ظروف معقمة باستخدام 1 مل من محلول مخزون 20x Binding Buffer الذي تم سحبه إلى 19 مل من الماء المقطر الخالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
4. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم باستنشاق المادة الطافية ، وأضف الميكروبيدات ، واخلط العينة برفق ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   1. عندما يكون عدد الخلايا 10⁷ أو أقل ، أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات.
   2. بالنسبة للأعداد التي تزيد عن 10⁷ خلايا إجمالية ، اضبط الميكروبيدات للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل 10⁷ خلايا حية.
5. أثناء الحضانة ، احصل على عمود اختيار موجب واحد ل MACS ، و MACS multistand ، والفاصل المغناطيسي المقابل. تأكد من تسوية الفاصل على الحامل المتعدد وعدم وجود جسم معدني أو مغناطيسي آخر بالقرب من الحامل ، حيث أن القوة المغناطيسية قوية ويمكن أن تؤثر على كفاءة إزالة الخلايا الميتة. ضع العمود بإحكام في حامل فاصل مع توجيه الأجنحة للخارج.
6. بعد حضانة العينة ، إذا كان إجمالي حجم إعادة التعليق أقل من 500 ميكرولتر ، أضف 1x Binding Buffer حتى يصبح الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر.
7. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل أسفل العمود وقم بتجهيز العمود ب 3 مل من 1x Binding Buffer.
8. استبدل الأنبوب المخروطي بأنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل لجمع عينات الخلايا وأضف العينة إلى العمود ، مما يسمح لها بالتدفق بالكامل عبر العمود.
9. اغسل العمود 4 × 3 مل من 1x Binding Buffer ، مع إضافة غسلة واحدة فقط في كل مرة بعد تدفق الغسيل السابق بالكامل عبر العمود.
10. بعد الغسيل الرابع ، يتم طرد الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية. تجاهل العمود والمخزن المؤقت للربط 1x المتبقي.
11. أعد تعليق محلول العينة في الكمية المناسبة من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وعد الخلايا المعزولة باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 5 (الشكل 3 والشكل 5).
    1. إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ ، وكان العدد الإجمالي للخلايا 10⁶ أو أقل ، كرر القسم 6.
    2. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

النتائج

تم الحصول على خزعة سرطان الجلد المعلقة في RPMI ووضعها على الفور على الجليد. تم نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 420 ميكرولتر من RPMI وإنزيمات الهضم ، وتم فرمها إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ، وخضعت للهضم الأنزيمي اللاحق لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري رأسيا 37 درجة مئوية (?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تفكك عينات ورم الإنسان أو الفئران إلى تعليق خلية واحدة لتسلسل scRNA باستخدام نظام الموائع الدقيقة 10x Genomics. عند معالجة الأنسجة التي غالبا ما تأتي من سرطانات نادرة أو تشكل جزءا من التجارب السريرية الجارية أو التجارب الطويلة لأورام الفئران ، يجب الحفاظ على العينة على النحو ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C