Dissociazione di campioni di tessuto tumorale umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Riepilogo

Questo protocollo delinea la procedura per dissociare rapidamente campioni di tumore umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

I campioni di tumore umano contengono una pletora di informazioni sul loro microambiente e sul loro repertorio immunitario. L'efficace dissociazione di campioni di tessuto umano in sospensioni cellulari vitali è un input necessario per la pipeline di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq). A differenza degli approcci di sequenziamento dell'RNA di massa, scRNAseq ci consente di dedurre l'eterogeneità trascrizionale nei campioni tumorali a livello di singola cellula. L'incorporazione di questo approccio negli ultimi anni ha portato a molte scoperte, come l'identificazione degli stati immunitari e cellulari tumorali e dei programmi associati alle risposte cliniche alle immunoterapie e ad altri tipi di trattamenti. Inoltre, le tecnologie a singola cellula applicate ai tessuti dissociati possono essere utilizzate per identificare le regioni della cromatina accessibili, il repertorio dei recettori delle cellule T e B e l'espressione di proteine, utilizzando anticorpi con codice a barre del DNA (CITEseq).

La vitalità e la qualità del campione dissociato sono variabili critiche quando si utilizzano queste tecnologie, in quanto possono influenzare notevolmente la contaminazione incrociata di singole cellule con l'RNA ambientale, la qualità dei dati e l'interpretazione. Inoltre, lunghi protocolli di dissociazione possono portare all'eliminazione di popolazioni cellulari sensibili e alla sovraregolazione di una firma genica di risposta allo stress. Per superare questi limiti, abbiamo ideato un protocollo di dissociazione universale rapida, che è stato validato su diversi tipi di tumori umani e murini. Il processo inizia con la dissociazione meccanica ed enzimatica, seguita dalla filtrazione, dalla lisi dei globuli rossi e dall'arricchimento dei morti vivi, adatti per campioni con un basso apporto di cellule (ad esempio, biopsie con nucleo dell'ago). Questo protocollo garantisce una sospensione a singola cellula pulita e vitale, fondamentale per il successo della generazione di emulsioni Gel Bead-In (GEM), dei codici a barre e del sequenziamento.

Introduzione

Sebbene molti progressi nella ricerca sul cancro abbiano portato allo sviluppo e all'approvazione da parte della FDA di agenti mirati ai recettori inibitori espressi sulle cellule immunitarie e tumorali, noti come inibitori del blocco del checkpoint, la resistenza alla terapia e l'identificazione dei meccanismi che guidano la risposta del paziente rimangono difficili¹. La complessa sfida di caratterizzare l'eterogeneità del tumore sulla sua diversità molecolare e l'intricata interazione tra le cellule tumorali e il microambiente immunitario richiede nuovi approcci per sezionare questo complesso ecosistema alla risoluzione di una singola cellula....

Protocollo

Questo studio ha rispettato tutte le linee guida istituzionali relative al campionamento di tessuti umani. Il consenso informato è stato ricevuto dai pazienti e i dati identificabili del campione sono stati resi anonimi. I campioni vengono raccolti in sala operatoria, inseriti in una soluzione di RPMI, soluzione salina o PBS e confermati cancerosi tramite il reparto di patologia prima dell'uso nella ricerca. Tutti i passaggi, tranne quando indicato, devono essere eseguiti a 4 °C o su ghiaccio. Lavorare all'interno di una cappa di biosicurezza durante la lavorazione di tessuti umani. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materia....

Discussione

Questo protocollo descrive la dissociazione di campioni tumorali umani o murini in una sospensione di una singola cellula per il sequenziamento di scRNA utilizzando il sistema microfluidico 10x Genomics. Nella lavorazione di tessuti che spesso provengono da tumori rari o fanno parte di studi clinici in corso o di lunghi esperimenti per tumori murini, il campione deve essere conservato in modo ottimale e accurato tra tutte le fasi. Tutti i passaggi devono essere eseguiti rapidamente su ghiaccio o a 4 °C per mantenere i p.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C