Dissociazione di campioni di tessuto tumorale umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Riepilogo

Questo protocollo delinea la procedura per dissociare rapidamente campioni di tumore umano e di topo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

I campioni di tumore umano contengono una pletora di informazioni sul loro microambiente e sul loro repertorio immunitario. L'efficace dissociazione di campioni di tessuto umano in sospensioni cellulari vitali è un input necessario per la pipeline di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq). A differenza degli approcci di sequenziamento dell'RNA di massa, scRNAseq ci consente di dedurre l'eterogeneità trascrizionale nei campioni tumorali a livello di singola cellula. L'incorporazione di questo approccio negli ultimi anni ha portato a molte scoperte, come l'identificazione degli stati immunitari e cellulari tumorali e dei programmi associati alle risposte cliniche alle immunoterapie e ad altri tipi di trattamenti. Inoltre, le tecnologie a singola cellula applicate ai tessuti dissociati possono essere utilizzate per identificare le regioni della cromatina accessibili, il repertorio dei recettori delle cellule T e B e l'espressione di proteine, utilizzando anticorpi con codice a barre del DNA (CITEseq).

La vitalità e la qualità del campione dissociato sono variabili critiche quando si utilizzano queste tecnologie, in quanto possono influenzare notevolmente la contaminazione incrociata di singole cellule con l'RNA ambientale, la qualità dei dati e l'interpretazione. Inoltre, lunghi protocolli di dissociazione possono portare all'eliminazione di popolazioni cellulari sensibili e alla sovraregolazione di una firma genica di risposta allo stress. Per superare questi limiti, abbiamo ideato un protocollo di dissociazione universale rapida, che è stato validato su diversi tipi di tumori umani e murini. Il processo inizia con la dissociazione meccanica ed enzimatica, seguita dalla filtrazione, dalla lisi dei globuli rossi e dall'arricchimento dei morti vivi, adatti per campioni con un basso apporto di cellule (ad esempio, biopsie con nucleo dell'ago). Questo protocollo garantisce una sospensione a singola cellula pulita e vitale, fondamentale per il successo della generazione di emulsioni Gel Bead-In (GEM), dei codici a barre e del sequenziamento.

Introduzione

Sebbene molti progressi nella ricerca sul cancro abbiano portato allo sviluppo e all'approvazione da parte della FDA di agenti mirati ai recettori inibitori espressi sulle cellule immunitarie e tumorali, noti come inibitori del blocco del checkpoint, la resistenza alla terapia e l'identificazione dei meccanismi che guidano la risposta del paziente rimangono difficili¹. La complessa sfida di caratterizzare l'eterogeneità del tumore sulla sua diversità molecolare e l'intricata interazione tra le cellule tumorali e il microambiente immunitario richiede nuovi approcci per sezionare questo complesso ecosistema alla risoluzione di una singola cellula. Comprendere le complessità molecolari all'interno dei tumori e dei loro microambienti è fondamentale per far progredire le strategie terapeutiche e decifrare la complessa biologia alla base della progressione del cancro². Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è diventato sempre più popolare perché fornisce analisi ad alta risoluzione di singole cellule all'interno di campioni tumorali complessi ^3,4.

L'eterogeneità dei tumori, che comprende le diversità genetiche, epigenetiche e fenotipiche, rappresenta una sfida per scoprire le complessità della biologia del cancro⁵. I metodi convenzionali di sequenziamento dell'RNA di massa tendono a oscurare i profili di espressione e i fenotipi unici delle popolazioni cellulari eterogenee presenti all'interno dei tumori, poiché questi metodi fanno la media dei segnali in intere popolazioni cellulari⁴. Al contrario, lo scRNA-seq consente la dissezione di singoli tipi di cellule, rivelando diverse espressioni geniche, modelli di repressione e stati cellulari altrimenti trascurati ^4,6. La premessa di scRNA-seq risiede nella sua capacità di decodificare le firme genetiche e molecolari delle singole cellule, rivelando un'immensa promessa nella scoperta di nuove terapie antitumorali⁷.

Decifrando i profili di espressione genica delle cellule tumorali e delle cellule stromali e immunitarie circostanti, i ricercatori possono identificare nuovi bersagli terapeutici e sviluppare strategie di medicina genetica di precisione su misura per i singoli pazienti⁶. Inoltre, l'analisi del repertorio immunitario all'interno del microambiente tumorale fornisce informazioni cruciali sull'interazione tra cellule tumorali ed effettori immunitari, aprendo la strada a interventi immunoterapeutici³. Nonostante i progressi nell'uso di scRNAseq su campioni clinici, diverse sfide durante le fasi di elaborazione possono danneggiare l'integrità, la vitalità e la qualità dell'RNA della cellula dei dati generati. Inoltre, il trattamento di tessuti con bassa vitalità cellulare può aumentare i livelli di RNA ambientale nelle goccioline generate durante l'incapsulamento delle singole cellule, con conseguente contaminazione incrociata e annotazione errata dei tipi di cellule, mentre lunghi protocolli di dissociazione eseguiti a 37 °C possono portare alla sovraregolazione di una firma genica di risposta allo stress in più tipi di cellule ^{8,9, 10}.

La procedura graduale (Figura 1A) delineata in questo protocollo inizia con una rapida dissociazione meccanica ed enzimatica dei tumori, seguita dalla filtrazione e dalla rimozione delle cellule morte, a seconda della vitalità di ciascun campione tumorale. Attualmente, questa procedura è stata verificata in campioni di melanoma¹¹, colon-retto¹², carcinoma a cellule squamose¹³ della testa e del collo, pancreas e polmone (dati non pubblicati). Queste tecniche garantiscono la generazione di sospensioni cellulari vitali di alta qualità, fondamentali per le analisi a valle¹⁴. In particolare, la rimozione dei globuli rossi, privi di RNA sintetizzato, diventa indispensabile per purificare il campione¹⁵. La successiva valutazione della conta cellulare e l'eliminazione delle cellule morte fungono da prerequisito per il successo della generazione di 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM), della codifica a barre e dell'aumento del recupero dei trascritti e delle cellule sequenziate senza compromettere l'esclusione delle popolazioni sensibili (ad esempio, neutrofili e cellule epiteliali)¹⁶. Questi passaggi sono fondamentali per sbloccare il potenziale dell'analisi della risoluzione di singole cellule all'interno di campioni tumorali ^9,10, scoprire nuovi profili di espressione genica e firme immunitarie necessarie per guidare interventi terapeutici innovativi e identificare nuove vulnerabilità tumorali.

Protocollo

Questo studio ha rispettato tutte le linee guida istituzionali relative al campionamento di tessuti umani. Il consenso informato è stato ricevuto dai pazienti e i dati identificabili del campione sono stati resi anonimi. I campioni vengono raccolti in sala operatoria, inseriti in una soluzione di RPMI, soluzione salina o PBS e confermati cancerosi tramite il reparto di patologia prima dell'uso nella ricerca. Tutti i passaggi, tranne quando indicato, devono essere eseguiti a 4 °C o su ghiaccio. Lavorare all'interno di una cappa di biosicurezza durante la lavorazione di tessuti umani. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Ottenimento del campione

1. Prelevare un campione di tumore solido in una provetta di terreno e metterlo sul ghiaccio.
   1. Istruire il personale della sala operatoria a trasportare il campione in una provetta contenente abbastanza RPMI, soluzione salina o PBS per immergere completamente il tessuto per evitare la disidratazione del campione.
      NOTA: Assicurarsi che il campione non sia essiccato è importante, in quanto ciò ridurrà la vitalità.
2. Raffreddare tutte le centrifughe a 4 °C e portare il miscelatore termico a 37 °C.
3. Estrarre gli enzimi di dissociazione tumorale umana o murina preparati (Tabella dei materiali), scongelarli con il miscelatore termico a 37 °C e passare al ghiaccio una volta scongelati.
4. Recuperare un'aliquota di 20 ml di RPMI.
5. Registrare le informazioni rilevanti sul campione (ad esempio, ID paziente, de-identificazione, tipo di campione).
6. Trasferire il campione in una piastra di coltura tissutale da 60 mm (posta sul ghiaccio) capovolgendo più volte la provetta e versando il contenuto nella piastra per garantire il trasferimento di tutto il materiale del campione. Se il campione non è stato consegnato nel supporto all'arrivo, aggiungere nuovi supporti RPMI al piatto.
   1. Se il campione è frammentato, centrifugare la provetta contenente il campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti, scartare il surnatante, risospendere il campione in 420 μl di RPMI e passare alla sezione 2.

2. Digestione meccanica ed enzimatica

1. Pipettare 420 μl di terreno dal piatto del campione da 60 mm a una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Tentare di includere eventuali frammenti di campione sospesi nel supporto.
2. Trasferire il tessuto campione dal piatto da 60 mm alla provetta da 1,5 mL contenente il terreno utilizzando una pinzetta. Tagliare il campione con delle forbici pulite all'interno del tubo in modo che i pezzi abbiano un diametro massimo di 2-3 mm.
3. Aggiungere enzimi di digestione, preparati secondo le specifiche del produttore (Tabella dei materiali), al campione nei seguenti volumi: 42 μL di enzima H (proteasi non specifiche) per campioni umani, enzima D (proteasi non specifiche) per campioni murini, 21 μl di enzima R (proteasi non specifica) e 5 μl di enzima A (nucleasi).
4. Aggiungere altri 420 μL di terreno dalla capsula o fino al segno di 1 mL sulla provetta. Non superare i 420 μL di terreno.
5. Agitare il tubo per 5 s e posizionarlo in un miscelatore termico posizionato verticalmente su un lato (Figura 1B). Incubare a 37 °C, 450 giri/min, per 15 min.
   NOTA: Durante l'incubazione, estrarre tutti i materiali 10x Genomics necessari per la generazione di GEM, poiché richiedono 30 minuti per equilibrarsi a temperatura ambiente

3. Filtraggio dei campioni

1. Posizionare un filtro cellulare da 50 μm sopra una nuova provetta conica da 15 mL e adescare il filtro facendo passare 1 mL di terreno RPMI fresco attraverso di esso nella provetta.
2. Dopo la digestione, trasferire il campione nella provetta da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta largo a bassa ritenzione da 1.000 μl. Lavare la provetta da 1,5 mL con 1 mL di terreno fresco e trasferire il terreno nel filtro per assicurarsi che tutto il materiale campione venga fatto passare attraverso il filtro.
3. Prenda una siringa di plastica da 1 ml ed estragga solo lo stantuffo (getti via il resto della siringa). Utilizzando la parte posteriore dello stantuffo della siringa, macinare e spingere il campione sul filtro con un movimento rotatorio.
4. Lavare il filtro con 5 mL di terreno e qualsiasi terreno rimanente dalla piastra che conteneva il campione (sezione 1) per raccogliere eventuali cellule che potrebbero essersi staccate dal tessuto.
5. Posizionare un filtro cellulare da 30 μm sopra una nuova provetta conica da 15 mL, adescare il filtro con 1 mL di terreno e trasferire il contenuto della provetta contenente il campione dissociato attraverso il filtro.
   NOTA: Questo passaggio rimuoverà i detriti di grandi dimensioni che potrebbero ostruirsi o causare un errore di bagnatura durante l'esecuzione del campione utilizzando i chip microfluidici 10x Genomics.

4. Lisi dei globuli rossi

1. Centrifugare il campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti. Aspirare il fluido, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
2. Risospendere nel tampone ACK Lysis per rimuovere i globuli rossi (RBC) e registrare il volume utilizzato. Il volume dipenderà dalla dimensione del pellet e dall'entità dei globuli rossi nel pellet.
   NOTA: La soluzione del campione di ACK risospeso deve essere incolore quando è stata aggiunta una quantità sufficiente di tampone di lisi ACK, in quanto ciò eliminerà i globuli rossi dal campione.
3. Centrifugare la provetta del campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti e aspirare il surnatante.
4. Ripetere i passaggi 4.2-4.3 secondo necessità fino a quando il pellet campione non ha un colore rosso visibile dopo la centrifugazione (Figura 2). Registrare eventuali volumi extra di tampone di lisi ACK utilizzato in questo passaggio.
5. Risospendere il pellet di campione in un terreno fresco in preparazione per il conteggio.

5. Conteggio delle cellule

1. Mettere 10 μl di blu di tripano in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente le cellule dissociate, prelevare 10 μL di campione e mescolare (1:1) con il blu di tripano. Caricare 10 μl su ciascun lato di un emocitometro e contare le cellule.
2. Registrare la concentrazione delle cellule, la conta totale delle cellule vive, la percentuale di vitalità e il volume finale del terreno dopo il conteggio.
3. Assicurarsi che la conta cellulare sia compresa tra 700 e 1.200 cellule/μL (7 × 10, 5-1,2 × 10,⁶/mL) per un'esecuzione ottimale della genomica 10x.
   1. Se il campione è troppo concentrato, diluirlo con terreno e ricontarlo.
   2. Se il campione è troppo diluito, centrifugare il campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti e risospendere in un volume inferiore di terreno.
   3. Se la vitalità cellulare è inferiore all'80%, eseguire una procedura viva-morta per rimuovere le cellule morte.
   4. Se il numero di celle è inferiore a un milione, vedere la sezione 6.
   5. Se le cellule sono superiori a un milione e la vitalità > del 10%, vedere paragrafo 6.
   6. Se le cellule sono superiori a un milione e la vitalità < del 10%, vedere paragrafo 7.
   7. Se la vitalità cellulare è superiore all'80%, mantenere le cellule lavorate su ghiaccio e procedere immediatamente alla generazione GEM secondo le istruzioni del produttore.

6. Rimozione delle celle morte - Kit 1

NOTA: Lavorare all'interno di una cappa di biosicurezza quando si utilizzano i reagenti per la rimozione delle cellule morte, poiché questi possono essere facilmente contaminati.

1. Centrifugare il campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti.
2. Preparare i terreni isolanti in una provetta conica da 15 mL e mantenerla a temperatura ambiente: 9,8 mL di PBS, 10 μL di CaCl₂ e 200 μL di FCS inattivato termicamente (aggiunto in una cappa di biosicurezza).
3. Dopo la centrifugazione, aspirare il terreno dal pellet e risospendere in 1 mL di terreno di isolamento.
4. Centrifugare nuovamente la provetta a 450 × g, 4 °C per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di terreno di isolamento.
5. Trasferire 100 μl di campione in terreni di isolamento in un pozzetto di una provetta per PCR da 0,2 mL.
6. In una cappa di biosicurezza, aggiungere 10 μl di cocktail di annessina V e 10 μl di cocktail di selezione della biotina al pozzetto contenente 100 μl di campione in terreno di isolamento. Pipettare, mescolare la soluzione e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 4 minuti.
7. Dopo 4 minuti, agitare le particelle magnetiche rivestite di destrano per 30 s. Aggiungere 20 μl di microsfere e 60 μl di mezzi isolanti al campione (un volume totale di 200 μl). Se la vitalità è inferiore al 40%, scalare la quantità di microsfere fino a 40 μl regolando il volume del mezzo isolante (fino a 40 μl), mantenendo un volume totale di 200 μl. Pipettare la miscela e lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per 3 minuti.
8. Posizionare la provetta su un separatore magnetico genomico 10x (con l'impostazione alta) per 5 minuti a temperatura ambiente.
9. Trasferire il liquido dalla provetta a strisce senza disturbare le perle in una nuova provetta per microcentrifuga lo-bind da 1,5 mL. Non rimuovere il tubo a strisce dal magnete.
10. Centrifugare la provetta da 1,5 mL contenente il campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un volume appropriato di terreno RPMI in base alle dimensioni del pellet e al conteggio delle cellule, come descritto nel paragrafo 5. Ripetere la procedura di rimozione delle cellule morte se la vitalità rimane al di sotto dell'80% (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Non risospendere le cellule nei terreni di isolamento per la generazione di GEM a valle, poiché il cloruro di calcio interferirà con il processo di incapsulamento e la fase di trascrizione inversa (RT).
11. Mantenere le cellule lavorate in ghiaccio se la vitalità cellulare è superiore all'80% e procedere immediatamente alla generazione GEM secondo le istruzioni del produttore.

7. Rimozione delle celle morte - Kit 2

NOTA: Lavorare all'interno di una cappa di biosicurezza quando si utilizzano i reagenti del kit.

1. Posizionare le microsfere e la soluzione madre 20x Binding Buffer all'interno di una cappa di biosicurezza.
2. Centrifugare la sospensione del campione a 450 × g, 4 °C per 5 minuti.
3. Preparare 1 soluzione tampone in condizioni sterili utilizzando 1 mL della soluzione madre 20x Binding Buffer pipettata in 19 mL di acqua distillata priva di DNAsi e RNAsi.
4. Una volta completata la centrifugazione, aspirare il surnatante, aggiungere le microsfere, mescolare delicatamente il campione e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
   1. Quando la conta cellulare è pari o inferiore a 10,⁷ , aggiungere 100 μl di microsfere.
   2. Per conteggi superiori a^10-7 cellule totali, regolare le microsfere per una concentrazione finale di 100 μl per 10-7 cellule vive.
5. Durante l'incubazione, ottenere una colonna di selezione positiva MACS, un multistand MACS e il corrispondente separatore magnetico. Assicurarsi che il separatore sia livellato sul multistand e che nessun altro oggetto metallico o magnetico si trovi vicino al supporto, poiché la forza magnetica è potente e potrebbe influire sull'efficienza di rimozione delle celle morte. Posizionare la colonna in modo aderente in un supporto separatore con le ali rivolte verso l'esterno.
6. Dopo l'incubazione del campione, se il volume totale di risospensione è inferiore a 500 μl, aggiungere 1x tampone legante fino a quando il volume totale non è di 500 μl.
7. Posizionare una provetta conica da 15 mL sotto la colonna e adescare la colonna con 3 mL di 1x Binding Buffer.
8. Sostituire la provetta conica con una nuova da 15 mL conica per la raccolta del campione cellulare e aggiungere il campione alla colonna, consentendogli di fluire completamente attraverso la colonna.
9. Lavare la colonna con 4 x 3 mL di 1x tampone legante, aggiungendo solo un lavaggio alla volta dopo che il lavaggio precedente è passato interamente attraverso la colonna.
10. Dopo il quarto lavaggio, centrifugare la provetta conica contenente le cellule isolate per 5 minuti a 450 × g, 4 °C. Eliminare la colonna e il buffer di binding 1x rimanente.
11. Risospendere la soluzione campione nella quantità appropriata di terreno RPMI in base alla dimensione del pellet e contare le celle isolate utilizzando il metodo descritto nella sezione 5 (Figura 3 e Figura 5).
    1. Se la vitalità rimane al di sotto dell'80% e il numero totale di cellule è pari o inferiore a 10⁶ , ripetere la sezione 6.
    2. Se la vitalità cellulare è superiore all'80%, mantenere le cellule trattate su ghiaccio e procedere immediatamente alla generazione GEM secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

È stata prelevata una biopsia del melanoma sospesa in RPMI e immediatamente posta su ghiaccio. Il campione è stato trasferito in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 420 μL di RPMI ed enzimi per la digestione, tritato in piccoli pezzi con l'aiuto di forbici e sottoposto a successiva digestione enzimatica per 15 minuti in un miscelatore termico posizionato verticalmente a 37 °C (Figura 1). Dopo la digestione, il campione è stato filtrato attraverso un filtro monouso steri...

Discussione

Questo protocollo descrive la dissociazione di campioni tumorali umani o murini in una sospensione di una singola cellula per il sequenziamento di scRNA utilizzando il sistema microfluidico 10x Genomics. Nella lavorazione di tessuti che spesso provengono da tumori rari o fanno parte di studi clinici in corso o di lunghi esperimenti per tumori murini, il campione deve essere conservato in modo ottimale e accurato tra tutte le fasi. Tutti i passaggi devono essere eseguiti rapidamente su ghiaccio o a 4 °C per mantenere i p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C