解离人和小鼠肿瘤组织样品用于单细胞 RNA 测序

摘要

该方案概述了快速解离人和小鼠肿瘤样品以进行单细胞 RNA 测序的程序。

摘要

人类肿瘤样本包含有关其微环境和免疫库的大量信息。将人体组织样品有效解离成活细胞悬液是单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 流程所需的起始量。与大量 RNA 测序方法不同，scRNAseq 使我们能够在单细胞水平推断肿瘤标本中的转录异质性。近年来，采用这种方法带来了许多发现，例如识别免疫和肿瘤细胞状态以及与免疫疗法和其他类型治疗的临床反应相关的程序。此外，应用于解离组织的单细胞技术可用于使用 DNA 条形码抗体 （CITEseq） 识别可接近的染色质区域 T 和 B 细胞受体库以及蛋白质的表达。

使用这些技术时，解离样品的活力和质量是关键变量，因为这些会极大地影响单细胞与环境 RNA 的交叉污染、数据质量和解释。此外，长解离方案可导致敏感细胞群的消除和应激反应基因特征的上调。为了克服这些限制，我们设计了一种快速通用解离方案，该方案已在多种类型的人和小鼠肿瘤上得到验证。该过程从机械和酶解离开始，然后是过滤、红血裂解和活死富集，适用于细胞起始量低的样品（例如，针芯活检）。该方案可确保清洁且有活力的单细胞悬液，这对于成功生成凝胶微珠内乳液 （GEM）、条形码和测序至关重要。

引言

尽管癌症研究的许多进步导致针对免疫和肿瘤细胞上表达的抑制性受体的药物（称为检查点阻断抑制剂）的开发并获得 FDA 批准，但治疗耐药性和确定驱动患者反应的机制仍然具有挑战性¹。表征肿瘤分子多样性的异质性以及肿瘤细胞与免疫微环境之间错综复杂的相互作用的复杂挑战，需要新的方法来以单细胞分辨率剖析这个复杂的生态系统。了解肿瘤及其微环境中的分子复杂性对于推进治疗策略和破译癌症进展的复杂生物学至关重要²。单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 越来越受欢迎，因为它可以对复杂肿瘤样本中的单个细胞进行高分辨率分析 ^3,4。

肿瘤异质性，包括遗传、表观遗传和表型多样性，对揭示癌症生物学的复杂性构成了挑战⁵。传统的大量 RNA 测序方法往往会掩盖肿瘤中存在的异质细胞群的独特表达谱和表型，因为这些方法会平均整个细胞群的信号⁴。相比之下，scRNA-seq 允许解剖单个细胞类型，揭示不同的基因表达、抑制模式和细胞状态，否则会被忽视 ^4,6。scRNA-seq 的前提是它能够....

研究方案

本研究符合有关人体组织采样的所有机构指南。获得患者的知情同意，并对可识别的样本数据进行匿名化处理。在手术室收集样本，置于 RPMI、生理盐水或 PBS 溶液中，并在用于研究之前通过病理科确认癌变。除非另有说明，否则所有步骤均应在 4 °C 或冰上进行。处理人体组织时，在生物安全罩内工作。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 获取样本

1. 在一管培养基中获取实体瘤样品并将其置于冰上。
   1. 指示手术室工作人员将样品装在含有足够 RPMI、生理盐水或 PBS 的试管中运输，以完全浸没组织以避免样品脱水。
      注意：确保样品未干燥很重要，因为这会降低活力。
2. 将所有离心机冷却至 4 °C，并将热混合器加热至 37 °C。
3. 取出准备好的人或小鼠肿瘤解离酶（材料表），在 37 °C 热混合器上解冻，解冻后移至冰中。
4. 取回 20 mL 等分试样的 RPMI。
5. 记录相关的样本信息（例如，患者 ID、去标识符、样本类型）。
6. 将试管倒置数次，然后将内容物倒入培养皿中，以确保转移所有样品材料，将样品转移到 60 mm 组织培养皿（置于冰上）中。如果样品在到达时未以培养基形式交付，请在培养皿中加入新鲜的 RPMI ....

讨论

该方案描述了人或小鼠肿瘤样品解离成单细胞悬液，以使用 10x Genomics 微流控系统进行 scRNA 测序。在处理通常来自罕见癌症的组织或正在进行的临床试验或小鼠肿瘤长期实验的组织时，必须在所有步骤之间以最佳方式仔细保存样品。所有步骤都应在冰上或 4 °C 下快速进行，以保持天然细胞 RNA 谱并防止降解，因为在室温下长时间工作会影响转录组质量^17,18

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C