Tek Hücreli RNA Dizilimi için İnsan ve Fare Tümör Dokusu Örneklerinin Ayrışması

Özet

Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi için insan ve fare tümör örneklerini hızlı bir şekilde ayırma prosedürünü ana hatlarıyla belirtir.

Özet

İnsan tümör örnekleri, mikro çevreleri ve bağışıklık repertuarları hakkında bol miktarda bilgi içerir. İnsan doku örneklerinin canlı hücre süspansiyonlarına etkili bir şekilde ayrışması, tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq) boru hattı için gerekli bir girdidir. Toplu RNA dizileme yaklaşımlarından farklı olarak, scRNAseq, tümör örneklerinde tek hücre düzeyinde transkripsiyonel heterojenliği çıkarmamızı sağlar. Son yıllarda bu yaklaşımın dahil edilmesi, bağışıklık ve tümör hücresel durumlarının tanımlanması ve immünoterapilere ve diğer tedavi türlerine klinik yanıtlarla ilişkili programlar gibi birçok keşfe yol açmıştır. Ayrıca, ayrışmış dokulara uygulanan tek hücreli teknolojiler, DNA barkodlu antikorlar (CITEseq) kullanılarak erişilebilir kromatin bölgeleri T ve B hücre reseptör repertuarını ve proteinlerin ekspresyonunu tanımlamak için kullanılabilir.

Ayrışmış numunenin canlılığı ve kalitesi, bu teknolojileri kullanırken kritik değişkenlerdir, çünkü bunlar, tek hücrelerin ortam RNA'sı ile çapraz kontaminasyonunu, verilerin kalitesini ve yorumlamayı önemli ölçüde etkileyebilir. Ayrıca, uzun ayrışma protokolleri, hassas hücre popülasyonlarının ortadan kaldırılmasına ve bir stres tepkisi gen imzasının yukarı regülasyonuna yol açabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, birden fazla insan ve fare tümörü tipinde doğrulanmış hızlı bir evrensel ayrışma protokolü tasarladık. İşlem, mekanik ve enzimatik ayrışma ile başlar, ardından filtrasyon, kırmızı kan lizisi ve düşük hücre girdisine sahip numuneler (örneğin, iğne çekirdeği biyopsileri) için uygun olan canlı ölü zenginleştirme ile devam eder. Bu protokol, Jel Boncuk Emülsiyonlarının (GEM'ler) başarılı bir şekilde üretilmesi, barkodlama ve sıralama için çok önemli olan temiz ve canlı bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Giriş

Kanser araştırmalarındaki birçok ilerleme, kontrol noktası blokaj inhibitörleri olarak bilinen, bağışıklık ve tümör hücreleri üzerinde eksprese edilen inhibitör reseptörleri hedef alan ajanların geliştirilmesine ve FDA onayına yol açmış olsa da, tedavi direnci ve hasta yanıtını yönlendiren mekanizmaların belirlenmesi zorlu olmaya devam etmektedir¹. Tümör heterojenliğini moleküler çeşitliliği ve tümör hücreleri ile immün mikroçevre arasındaki karmaşık etkileşim üzerinde karakterize etmenin karmaşık zorluğu, bu karmaşık ekosistemi tek hücre çözünürlüğünde incelemek için yeni yaklaşımlar gerektirmektedir. Tümörler ve mikro çevrelerindeki moleküler....

Protokol

Bu çalışma, insan dokusu örneklemesi ile ilgili tüm kurumsal kılavuzlara uygundur. Hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı ve tanımlanabilir örnek veriler anonim hale getirildi. Örnekler ameliyathanede toplanır, bir RPMI, salin veya PBS çözeltisine yerleştirilir ve araştırmada kullanılmadan önce patoloji bölümü tarafından kanserli olduğu doğrulanır. Belirtilen durumlar dışında tüm adımlar 4 °C'de veya buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. İnsan dokusunu işlerken bir biyogüvenlik başlığı içinde çalışın. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Nu....

Tartışmalar

Bu protokol, 10x Genomik mikroakışkan sistemi kullanılarak scRNA dizilimi için insan veya fare tümör örneklerinin tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasını tanımlar. Genellikle nadir kanserlerden gelen veya murin tümörleri için devam eden klinik deneylerin veya uzun deneylerin bir parçası olan dokuların işlenmesinde, numunenin tüm adımlar arasında en iyi ve dikkatli bir şekilde korunması gerekir. Doğal hücresel RNA profillerini korumak ve bozulmayı önlemek için tüm adımlar buz üzerinde ve.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C