دراسة تأثير الملوثات البيئية المستنشقة على وظيفة حاسة الشم في الفئران

Summary

تقدم هذه الورقة وصفا مفصلا لاختبار الطعام المدفون وتجربة تمييز الرائحة الاجتماعية لتقييم آثار التعرض للملوثات البيئية المستنشقة على وظيفة الشم في الفئران.

Abstract

ضعف حاسة الشم هو مشكلة صحية عامة كبيرة ويتنبأ بشكل مستقل بخطر الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية. قد يؤدي التعرض للملوثات البيئية المستنشقة إلى إضعاف حاسة الشم ؛ وبالتالي، هناك حاجة ملحة إلى أساليب لتقييم آثار التعرض للملوثات البيئية المستنشقة على حاسة الشم. الفئران هي نماذج مثالية للتجارب الشمية بسبب نظامها الشمي المتطور للغاية وخصائصها السلوكية. لتقييم آثار التعرض للملوثات البيئية المستنشقة على وظيفة حاسة الشم في الفئران ، يتم توفير اختبار مفصل للأغذية المدفونة وتجربة تمييز الرائحة الاجتماعية ، بما في ذلك إعداد التجربة ، واختيار وبناء المرافق التجريبية ، وعملية الاختبار ، ومؤشرات الوقت. وفي الوقت نفسه ، تتم مناقشة معدات ضبط الوقت والتفاصيل التشغيلية والبيئة التجريبية لضمان نجاح الفحص. تستخدم كبريتات الزنك كعلاج لإثبات جدوى النهج التجريبي. يوفر البروتوكول عملية تشغيلية بسيطة وواضحة لتقييم آثار الملوثات البيئية المستنشقة على وظيفة حاسة الشم في الفئران.

Introduction

برز ضعف حاسة الشم كمصدر قلق جدير بالملاحظة للصحة العامة ويرتبط بشكل مستقل بزيادة خطر الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية. يمكن أن تؤثر هذه الحالة سلبا على الرفاه العام ، وتساهم في تطور أعراض الاكتئاب ، وتؤدي إلى انخفاض نوعية الحياة. لوحظ تأثيره بشكل بارز في التصور المتغير للطعام ، وإعاقة التواصل الاجتماعي ، والمشاعر السلبية المتزايدة¹. تم اعتبار عوامل مختلفة ، بما في ذلك مرض الجيوب الأنفية ، وعدوى الجهاز التنفسي العلوي ، وإصابات الدماغ الرضحية ، من المساهمين في ضعف حاسة الشم لدى البشر². والجدير بالذكر أن الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق مثل PM2.5 ، والتي تقدر بتراوحها من 2٪ إلى 16٪ ، تدخل الجسم من خلال الهواء المستوحى ، وتجتاز تجويف الأنف ، وتصل إلى مناطق محددة مخصصة لحاسة الشم حيث يتم ترسبها^{3،4،5،6،7}. تشير النتائج الحديثة إلى أن الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق ، بما في ذلك PM2.5 والأمونيا ، يمكن أن تضر بالفعل بالخلايا العصبية الحسية^{الشمية 8،9،10}. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقق للتأكد مما إذا كان هذا الضرر يؤدي مباشرة إلى خلل في حاسة الشم. ومن ثم، فإن التقييم الدقيق لآثار الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق على وظيفة حاسة الشم له أهمية خاصة.

حاليا ، تستخدم العديد من مختبرات الأبحاث الفئران كنموذج فقاري بديل للتجارب السلوكية التي تهدف إلى فهم التغيرات في وظيفة حاسة الشم^{11،12،13،14}. تم اختيار الفئران كنظام نموذجي مفضل للتحقيق في الاتصالات الكيميائية للفقاريات ، ويظهر حساسية شمية ملحوظة حاسمة للبحث عن الطعام والتواصل الاجتماعي¹⁵. علاوة على ذلك ، فإن مجموعة الأدوات المتطورة باستمرار لمراقبة سلوك الفئران والتأثير عليه جعلت هذا النوع جذابا بشكل استثنائي للبحث في وظيفة حاسة الشم¹⁶.

في هذه الدراسة ، استخدمنا اختبار الطعام المدفون وتجربة تمييز الرائحة الاجتماعية لتقييم ضعف حاسة الشم في نموذج فأر معرض لملوثات بيئية قابلة للاستنشاق. لتعزيز دقة التقييم ، اخترنا الطريقة الأكثر تمثيلا لتقييم الوظيفة الشمية. قمنا بتحسين هذه الطريقة بشكل منهجي لضمان البساطة والوضوح ، مما يسمح لنا بقياس مدى الخلل الشمي الناجم عن الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق بشكل فعال.

Protocol

استخدمنا ذكور الفئران C57BL / 6J (العمر: 6-8 أسابيع ؛ الوزن: 20-22 جم) لجميع الاختبارات السلوكية. تعرضت الفئران لظروف ثابتة (أي درجة الحرارة ، 23 ± 1 درجة مئوية ؛ الرطوبة ، 55٪ ± 5٪ ، ودورة الضوء والظلام 12/12 ساعة مع إضاءة الأضواء في الساعة 7:00). تم إجراء جميع الاختبارات السلوكية بين الساعة 10:00 و 17:00. تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للجنة المهنية للتجارب على بجامعة تشينغداو. بعد فترة تأقلم لمدة أسبوع 1 ، تعرضت جميع الفئران للملوثات البيئية القابلة للاستنشاق.

1. التعرض للملوثات

1. الإدارة عن طريق الأنف عن طريق التقطير
   1. حل الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق في محلول ملحي 0.9٪. استخدم محلول كبريتات الزنك بنسبة 5٪ مرة واحدة ، والذي ثبت أنه يسبب اختلال وظيفي في حاسة الشم¹⁷. بالنسبة للفئران الضابطة، يتم تطبيق محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪.
   2. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق من 1 ٪ بنتوباربيتال الصوديوم¹⁸ وتقييم عمق التخدير باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم. ضع مرهم الطبيب البيطري على عيون الفأر لمنع الجفاف. ضع الماوس على ظهره على سطح مائل ، مع توجيه الرأس لأسفل.
   3. باستخدام مسدس ماصة ، قم بتطبيق 10 ميكرولتر من المحلول في فتحة أنف واحدة من الماوس ، مما يسمح باستنشاق المحلول بشكل طبيعي في تجويف الأنف.
   4. لضمان رفاهية الماوس ومنع أي إزعاج محتمل ، كرر استنشاق فتحة الأنف الأخرى بعد فاصل زمني مدته 10 دقائق.
   5. في 3 أيام بعد تناوله عن طريق الأنف عن طريق التقطير في الفئران ، قم بإجراء اختبار الطعام المدفون.

2. اختبار الطعام المدفون

1. نفذ الحرمان من الطعام في 18-24 ساعة قبل الاختبار عن طريق إزالة جميع كريات تشاو من قادوس الطعام في القفص المنزلي. تغيير مواد الفراش للفئران. لا تقم بإزالة زجاجة الماء.
2. رتب جدول التشغيل كما هو موضح أدناه.
   1. في 1 ساعة قبل بدء الاختبار ، خذ القفص الذي يحتوي على الفئران إلى غرفة العمليات للراحة.
   2. ترتيب غرفة العمليات خلال هذه الفترة. استخدم أقفاص الفئران القياسية البلاستيكية الشفافة وقم بتمييزها على أنها A لأنها تخلق بيئة مألوفة. استخدم قفص الاختبار وقم بتمييزه على أنه B ، وهو قفص سنجاب قياسي شفاف PVC. ضع علامة على القفص الشائع المستخدم لوضع الفئران بعد التجربة على أنه القفص C.
   3. قم بتغطية الأقفاص A و B ب 3 سم من مواد الفراش وقم بقياسها بمسطرة. رتب الأقفاص جنبا إلى جنب ، بمسافة 0.5 متر بين كل قفص (الشكل 1).
   4. حدد المنطقة التجريبية على أنها منطقة نصف قطرها 2 m، ويكون المركز هو مركز الأقفاص. حدد المنطقة خارج نطاق 2 م كمنطقة مراقبة.
   5. احتفظ بالقفص C والأقفاص التي تحتوي على فئران غير مختبرة بعيدا عن المنطقة التجريبية قدر الإمكان.
3. سجل الوقت للعثور على الطعام كما هو موضح أدناه.
   1. حدد موقعا عشوائيا في القفص B ، ودفن الطعام 1 سم تحت سطح الفراش ، وقم بتنعيم سطح الفراش.
   2. ضع الماوس في القفص A لمدة 4 دقائق. انقل الفئران إلى القفص B في نهاية التوقيت ، وقم بتشغيل جهاز الفيديو ، والعودة إلى منطقة المراقبة.
   3. عندما يلتقط الماوس كتلة الطعام بمقدمة مقدمته ، أوقف تسجيل الفيديو. في بعض الحالات ، يمكن رؤية الفئران تأكل ورؤوسها منحنية فوق الطعام. يشير هذا السلوك أيضا إلى نجاح التجربة ، حتى لو كان الماوس لا يحمل الطعام بمقدمة قدمه.
   4. تسجيل البيانات. سجل الوقت من ملامسة الحصيرة الموجودة أسفل القفص B حتى يتم العثور على طعام لكل ماوس. إذا لم تجد الفئران الطعام بعد 4 دقائق ، فقم بتسجيل وقت البحث كوقت تأخير قدره 240 ثانية.
   5. ضع الماوس في القفص C بعد الاختبار.
   6. أخرج العلف من القفص B وضعه في كيس مغلق. استبدل الطعام في القفص B واختبر الماوس التالي بعد تغيير مادة الفراش ، كما هو موضح أدناه.
      1. بالنسبة للفئران الموجودة في نفس القفص ، اختبر بنفس مجموعة مواد الفراش في القفص B. بالنسبة للفئران في أقفاص مختلفة ، قم بتنظيف القفص بالكحول واستبدل مواد الفراش.
   7. أضف العلف والماء إلى الفئران بعد التجربة. أداء تجربة التمييز رائحة الاجتماعية 1 يوم في وقت لاحق.
      ملاحظة: يجب ارتداء الأقنعة طوال العملية ، ويجب تغيير القفازات الشفافة بعد انتهاء كل فأر من التجربة لتجنب انتقال الرائحة قدر الإمكان. حافظ على سعة الحركات صغيرة قدر الإمكان لتجنب إجهاد الماوس.

3. تجربة التمييز بين الرائحة الاجتماعية

1. جمع البول
   1. جمع بشكل منفصل البول من الفئران الذكور الناضجة جنسيا والفئران الإناث والقسمة في أنابيب بأحجام متساوية¹⁹. حزمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل مع 300 ميكرولتر من البول في كل أنبوب.
   2. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. هز الأنابيب لتوزيع العينة بالتساوي بعد الذوبان. لا تذوب العينة وتجمدها بشكل متكرر.
2. رتب جدول التشغيل كما هو موضح أدناه.
   1. في 1 ساعة قبل بدء الاختبار ، خذ القفص الذي يحتوي على الفئران إلى غرفة العمليات للراحة.
   2. رتب غرفة العمليات خلال هذه الفترة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.5.
3. سجل الوقت للعثور على البول كما هو موضح أدناه.
   1. اصنع أخدودا بشريط لاصق حول كل من الجانبين العريضين للقفص B كبيرا بما يكفي لحمل أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من بول الذكور والإناث. ضع الأنابيب واحتفظ بغطاءي الأنبوب مغلقين في الوقت الحالي.
   2. ضع الماوس في القفص A واضبط العد التنازلي لمدة 4 دقائق. افتح أنبوبي القفص B في نهاية التوقيت.
   3. انقل الماوس إلى الموضع الأوسط للقفص B ، على نفس المسافة من الأنبوبين ، ثم قم بتشغيل معدات تسجيل الفيديو وتراجع برفق وببطء إلى منطقة المراقبة.
   4. عندما يشم الماوس جدار الأنبوب / الفم أو حتى داخل الأنبوب ، يتم شم رائحة الأنبوب بنجاح. في هذا الوقت ، اضغط على ساعة الإيقاف وسجل الوقت كوقت شم الأنبوب (M s) ، ثم استمر في تسجيل وقت الإقامة (X s) حتى يتحرك الماوس بعيدا عن الأنبوب.
   5. استمر في توقيت الوقت الذي تستنشق فيه الأنبوب الآخر. عندما يشم الماوس جدار الأنبوب / الفم أو حتى داخل الأنبوب ، يتم شم رائحة الأنبوب بنجاح. اضغط على ساعة الإيقاف وسجل الوقت المستغرق لشم رائحة الأنبوب الآخر (N s) ، ثم استمر في تسجيل وقت الإقامة (Y s) حتى يتحرك الماوس بعيدا عن الأنبوب.
   6. انقل الماوس إلى القفص C في نهاية التجربة.
   7. قم بتغيير أنابيب البول ومواد الفراش في القفص B بعد كل اختبار للفأر. ضع بول الفئران المستخدم في كيس نظيف حسب الجنس.
   8. قم بتغيير القفازات واختبر الماوس التالي كما هو موضح أعلاه.
4. قم بإجراء التجربة في المختبر بدون رائحة واضحة. تجنب المنتجات الشخصية التي تنبعث منها روائح قوية. ارتد القفازات والأقنعة طوال العملية لتجنب عبور الرائحة قدر الإمكان. حافظ على سعة الحركات صغيرة قدر الإمكان لتجنب إجهاد الماوس.

النتائج

الملوثات البيئية القابلة للاستنشاق تضعف وظيفة حاسة الشم في الفئران. ثبت أن الزنك الجوي المنبعث من المحارق والسيارات هو ملوث مستنشق يمكن أن يؤدي إلى التهاب الرئة التحسسي²⁰. تعتبر كبريتات الزنك أحد المركبات النموذجية التي تسبب اختلال وظيفي في حاسة الشم²¹. لذلك ، نست...

Discussion

تقدم هذه المقالة بروتوكولين أساسيين مصممين للتقييم السريع لضعف حاسة الشم في الفئران. تؤدي الملوثات البيئية المتنوعة القابلة للاستنشاق إلى مستويات متميزة من الخلل الوظيفي الشمي في الفئران. يتم استخدام اختبار الطعام المدفون لتقييم القدرة على اكتشاف الروائح المتطايرة ، بينما تقوم تجربة ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution