Изучение влияния вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей

Резюме

В данной статье представлено подробное описание теста на захороненную пищу и эксперимента по различению социальных запахов для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.

Аннотация

Нарушение обоняния является серьезной проблемой общественного здравоохранения и независимо прогнозирует риск нейродегенеративных заболеваний. Воздействие вдыхаемых загрязнителей окружающей среды может ухудшить обоняние; В связи с этим существует острая потребность в методах оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обоняние. Мыши являются идеальными моделями для обонятельных экспериментов из-за их высокоразвитой обонятельной системы и поведенческих характеристик. Для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей проводится подробный эксперимент по тестированию закопанных продуктов питания и социальному различению запахов, включая подготовку к эксперименту, выбор и строительство экспериментальных помещений, процесс тестирования и временные индексы. Между тем, для обеспечения успеха анализа обсуждаются оборудование для измерения времени, операционные детали и экспериментальная среда. Сульфат цинка используется в качестве обработки для демонстрации осуществимости экспериментального подхода. Протокол обеспечивает простой и понятный рабочий процесс оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.

Введение

Нарушение обоняния стало заслуживающей внимания проблемой общественного здравоохранения и независимо связано с повышенным риском нейродегенеративных заболеваний. Это состояние может негативно сказаться на общем самочувствии, способствовать развитию депрессивных симптомов и привести к снижению качества жизни. Его влияние заметно проявляется в измененном восприятии пищи, препятствиях в социальном общении и усилении негативных чувств¹. Различные факторы, включая синоназальные заболевания, инфекции верхних дыхательных путей и черепно-мозговую травму, считаются факторами, способствующими нарушению обоняния у людей². Примечательно, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, такие как PM2,5, по оценкам, составляют от 2% до 16%, попадают в организм через вдыхаемый воздух, пересекают носовую полость и достигают определенных областей, предназначенных для обоняния, где они откладываются 3,4,5,6,7. Последние результаты показывают, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, включая PM2,5 и аммиак, действительно могут нанести вред обонятельным сенсорным нейронам ^8,9,10. Тем не менее, требуется дальнейшая валидация, чтобы установить, приводит ли такое повреждение непосредственно к обонятельной дисфункции. Следовательно, тщательная оценка воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию имеет особое значение.

В настоящее время многочисленные исследовательские лаборатории используют мышей в качестве альтернативной модели позвоночных для поведенческих экспериментов, направленных на понимание изменений в обонятельной функции 11,12,13,14. Мыши были выбраны в качестве предпочтительной модельной системы для изучения химической коммуникации позвоночных, и они демонстрируют замечательную обонятельную чувствительность, имеющую решающее значение для поиска пищи и^{социальной коммуникации.} Кроме того, постоянно развивающийся набор инструментов для наблюдения и влияния на поведение мышей сделал этот вид исключительно привлекательным для исследований обонятельной^{функции.}

В этом исследовании мы использовали тест на закопанную пищу и эксперимент по социальной дискриминации запахов для оценки обонятельных нарушений на мышиной модели, подвергшейся воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды. Чтобы повысить точность оценки, мы выбрали наиболее репрезентативный метод оценки обонятельной функции. Мы систематически совершенствовали этот метод, чтобы обеспечить простоту и ясность, что позволяет нам эффективно измерять степень обонятельной дисфункции, вызванной вдыхаемыми загрязнителями окружающей среды.

протокол

Для всех поведенческих тестов мы использовали самцов мышей C57BL/6J (возраст: 6-8 недель; вес: 20-22 г). Мышей подвергали воздействию устойчивых условий (т.е. температура 23 ± 1 °C; влажность 55% ± 5% и 12-12-часовой цикл свет-темнота с включенным освещением в 7:00). Все поведенческие тесты проводились в период с 10:00 до 17:00. Все эксперименты на животных были одобрены Этическим комитетом Профессионального комитета по экспериментам на животных Университета Циндао. После 1-недельного периода акклиматизации все мыши подверглись воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды.

1. Воздействие загрязняющих веществ

1. Интраназальное введение методом инстилляции
   1. Растворите вдыхаемые загрязнители окружающей среды в 0,9% физиологическом растворе. Используйте 5% раствор сульфата цинка один раз, который, как было доказано, вызывает обонятельную дисфункцию¹⁷. Для контрольных мышей вводят 0,9% обычный физиологический раствор.
   2. Обезболивайте мышь путем внутрибрюшинного введения 1% пентобарбитала натрия¹⁸ и оцените глубину анестезии с помощью рефлекса пальцев ног. Нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость. Расположите мышь на спине на наклонной поверхности головой вниз.
   3. С помощью пистолета-пипетки введите 10 мкл раствора в одну ноздрю мыши, что позволяет естественным образом вдыхать раствор в носовую полость.
   4. Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мыши и предотвратить возможный дискомфорт, повторите ингаляцию для другой ноздри с интервалом в 10 минут.
   5. Через 3 дня после интраназального введения путем инстилляции мышам проведите тест с закопанной пищей.

2. Тест на закопанную пищу

1. Проведите депривацию пищи за 18-24 ч до испытания, удалив все гранулы корма из бункера для корма домашней клетки. Смените материалы подстилки для мышей. Не вынимайте бутылку с водой.
2. Расположите операционный стол так, как описано ниже.
   1. За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
   2. Обустройте операционную в этот период. Используйте и обозначьте прозрачные стандартные клетки для мышей из ПВХ как A, так как они создают знакомую среду. Используйте и обозначьте испытательную клетку как B, которая представляет собой прозрачную клетку для белок стандартного ПВХ. Отметьте общую клетку, в которую помещали мышей после эксперимента, как клетку С.
   3. Накройте клетки А и В 3 см подстилочного материала и отмерьте их линейкой. Расположите клетки рядом, с расстоянием 0,5 м между каждой клеткой (Рисунок 1).
   4. Определите экспериментальную зону как область радиусом 2 м, где центром являются центры клеток. Определите область за пределами диапазона 2 м в качестве зоны наблюдения.
   5. Держите клетку C и клетки с непроверенными мышами как можно дальше от экспериментальной зоны.
3. Запишите время, необходимое для поиска еды, как описано ниже.
   1. Выберите случайным образом место в клетке Б, закопайте корм на 1 см ниже поверхности подстилки и разровняйте поверхность подстилки.
   2. Поместите мышь в клетку А на 4 минуты. По окончании тайминга перенесите мышей в клетку В, включите видеоустройство и вернитесь в зону наблюдения.
   3. Когда мышь возьмет блок корма передней лапой, остановите видеозапись. В некоторых случаях можно увидеть, как мыши едят, склонив голову над едой. Такое поведение также указывает на успех испытания, даже если мышь не держит пищу передней лапой.
   4. Запись данных. Запишите время от контакта с ковриком на дне клетки B до того, как будет найден корм для каждой мыши. Если мыши не находят пищу через 4 минуты, запишите время поиска как время задержки в 240 с.
   5. Поместите мышь в клетку C после теста.
   6. Выньте корм из клетки Б и положите его в герметичный пакет. Замените корм в клетке B и проверьте следующую мышь после смены материала подстилки, как описано ниже.
      1. Для мышей, содержащихся в одной клетке, тестируйте с одним и тем же набором материалов подстилки в клетке В. Для мышей в разных клетках очистите клетку спиртом и замените подстилочные материалы.
   7. Добавляйте мышам корм и воду после эксперимента. Проведите эксперимент по распознаванию социальных запахов через 1 день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маски необходимо носить на протяжении всего процесса, а прозрачные перчатки необходимо менять после того, как каждая мышь закончит эксперимент, чтобы максимально избежать пересечения запахов. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.

3. Эксперимент по социальной дискриминации запахов

1. Сбор мочи
   1. Отдельно соберите мочу половозрелых самцов мышей и самок мышей и аликвоту в пробирки в равных объемах¹⁹. Упакуйте в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл по 300 мкл мочи в каждой пробирке.
   2. Храните образцы при температуре -80 ° C до использования. Встряхните пробирки, чтобы равномерно распределить образец после размораживания. Не размораживайте и не замораживайте образец повторно.
2. Расположите операционный стол так, как описано ниже.
   1. За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
   2. Организуйте операционную в течение этого периода, как описано в шагах 2.2.2-2.2.5.
3. Запишите время обнаружения мочи, как описано ниже.
   1. Сделайте канавку с помощью ленты вокруг каждой из двух широких сторон клетки В, достаточно большую, чтобы вместить микроцентрифужную пробирку, содержащую 300 мкл мужской и женской мочи. Поместите трубки и пока держите две крышки трубок закрытыми.
   2. Поместите мышь в клетку А и установите обратный отсчет на 4 минуты. Откройте две пробирки клетки B в конце тайминга.
   3. Перенесите мышь в среднее положение клетки В, на одинаковом расстоянии от двух трубок, затем включите видеозаписывающее оборудование и аккуратно и медленно отойдите к зоне наблюдения.
   4. Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. В это время нажмите секундомер и запишите время как время запаха трубки (M s), затем продолжайте записывать время пребывания (X с), пока мышь не отойдет от трубки.
   5. Продолжайте отсчитывать время, нюхая другую трубку. Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. Нажмите секундомер и запишите время, затраченное на то, чтобы понюхать другую трубку (N с), затем продолжайте записывать время пребывания (Y с), пока мышь не отойдет от трубки.
   6. В конце эксперимента перенесите мышь в клетку C.
   7. Меняйте пробирки для мочи и материал подстилки клетки B после каждого теста на мышах. Положите использованную крысиную мочу в чистый пакет в соответствии с полом.
   8. Смените перчатки и проверьте следующую мышь, как описано выше.
4. Проводите эксперимент в лабораторных условиях без явного запаха. Избегайте средств личной гигиены, которые выделяют резкие запахи. Надевайте перчатки и маски на протяжении всей процедуры, чтобы по возможности избежать пересечения запаха. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.

Результаты

Вдыхаемые загрязнители окружающей среды нарушают обонятельную функцию у мышей. Доказано, что атмосферный цинк, выделяемый из мусоросжигательных заводов и автомобилей, является вдыхаемым загрязнителем, который может привести к аллергическому воспалению^{легких20}. Сульфат ?...

Обсуждение

В этой статье представлены два фундаментальных протокола, предназначенных для быстрой оценки нарушения обоняния у мышей. Различные вдыхаемые загрязнители окружающей среды приводят к различным уровням обонятельной дисфункции у мышей. Тест на закопанную пищу используется для оценки с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution