Studio degli effetti degli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi

Riepilogo

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del test del cibo sepolto e dell'esperimento di discriminazione degli odori sociali per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi.

Abstract

La compromissione olfattiva è un problema significativo per la salute pubblica e predice in modo indipendente il rischio di malattie neurodegenerative. L'esposizione agli inquinanti ambientali inalati può compromettere l'olfatto; In tal modo, c'è un urgente bisogno di metodi per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sull'olfatto. I topi sono modelli ideali per esperimenti olfattivi grazie al loro sistema olfattivo altamente sviluppato e alle caratteristiche comportamentali. Per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi, viene fornito un test dettagliato del cibo sepolto e un esperimento di discriminazione degli odori sociali, compresa la preparazione dell'esperimento, la selezione e la costruzione di strutture sperimentali, il processo di test e gli indici di tempo. Nel frattempo, vengono discusse le apparecchiature di cronometraggio, i dettagli operativi e l'ambiente sperimentale per garantire il successo del test. Il solfato di zinco viene utilizzato come trattamento per dimostrare la fattibilità dell'approccio sperimentale. Il protocollo fornisce un processo operativo semplice e chiaro per valutare gli effetti degli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi.

Introduzione

La compromissione olfattiva è emersa come un problema di salute pubblica degno di nota ed è associata in modo indipendente a un aumento del rischio di malattie neurodegenerative. Questa condizione può influire negativamente sul benessere generale, contribuire allo sviluppo di sintomi depressivi e comportare una diminuzione della qualità della vita. Il suo impatto è evidente nell'alterata percezione del cibo, nell'ostacolo nella comunicazione sociale e nell'aumento dei sentimenti negativi¹. Vari fattori, tra cui la malattia sinonasale, l'infezione del tratto respiratorio superiore e le lesioni cerebrali traumatiche, sono stati considerati fattori che contribuiscono alla compromissione olfattiva nell'uomo². In particolare, gli inquinanti ambientali inalabili come il PM2,5, che si stima vadano dal 2% al 16%, entrano nel corpo attraverso l'aria inspirata, attraversano la cavità nasale e raggiungono specifiche regioni dedicate all'olfatto dove si depositano 3,4,5,6,7. Recenti scoperte indicano che gli inquinanti ambientali inalabili, tra cui PM2.5 e ammoniaca, possono effettivamente danneggiare i neuroni sensoriali olfattivi ^8,9,10. Tuttavia, è necessaria un'ulteriore convalida per accertare se tale danno porta direttamente a disfunzioni olfattive. Pertanto, una valutazione meticolosa degli effetti degli inquinanti ambientali inalabili sulla funzione olfattiva è di particolare importanza.

Attualmente, numerosi laboratori di ricerca impiegano i topi come modello alternativo di vertebrati per esperimenti comportamentali volti a comprendere i cambiamenti nella funzione olfattiva 11,12,13,14. I topi sono stati scelti come sistema modello preferito per lo studio della comunicazione chimica dei vertebrati, e mostra una notevole sensibilità olfattiva cruciale per il foraggiamento e la comunicazione sociale¹⁵. Inoltre, la gamma in continua evoluzione di strumenti per osservare e influenzare il comportamento dei topi ha reso questa specie eccezionalmente attraente per la ricerca sulla funzione olfattiva¹⁶.

In questo studio, abbiamo impiegato il test del cibo sepolto e l'esperimento di discriminazione degli odori sociali per valutare la compromissione olfattiva in un modello murino esposto a inquinanti ambientali inalabili. Per migliorare la precisione della valutazione, abbiamo optato per il metodo più rappresentativo per la valutazione della funzione olfattiva. Abbiamo sistematicamente perfezionato questo metodo per garantire semplicità e chiarezza, permettendoci di valutare efficacemente l'entità della disfunzione olfattiva indotta da inquinanti ambientali inalabili.

Protocollo

Abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6J (età: 6-8 settimane; peso: 20-22 g) per tutti i test comportamentali. I topi sono stati sottoposti a condizioni stabili (ad esempio, temperatura, 23 ± 1 °C; umidità, 55% ± 5% e ciclo luce-buio di 12/12 ore con luci accese alle 7:00). Tutti i test comportamentali sono stati eseguiti tra le 10:00 e le 17:00. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico del Comitato Professionale per gli Esperimenti sugli Animali dell'Università di Qingdao. Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, tutti i topi sono stati esposti a inquinanti ambientali inalabili.

1. Esposizione agli agenti inquinanti

1. Somministrazione intranasale per instillazione
   1. Sciogliere gli inquinanti ambientali inalabili in una soluzione salina allo 0,9%. Utilizzare una volta una soluzione di solfato di zinco al 5%, che ha dimostrato di causare disfunzioni olfattive¹⁷. Per i topi di controllo, somministrare una soluzione salina normale allo 0,9%.
   2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital 18 di sodio^all'1% e valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso del pizzicamento delle dita. Applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse sul dorso su una superficie inclinata, con la testa rivolta verso il basso.
   3. Utilizzando una pistola pipettatrice, somministrare 10 μl di soluzione in una narice del topo, consentendo di inalare naturalmente la soluzione nella cavità nasale.
   4. Per garantire il benessere del topo e prevenire qualsiasi potenziale disagio, ripetere l'inalazione per l'altra narice dopo un intervallo di 10 minuti.
   5. A 3 giorni dalla somministrazione intranasale mediante instillazione nei topi, eseguire il test del cibo sepolto.

2. Test del cibo sepolto

1. Effettuare la privazione del cibo a 18-24 ore prima del test rimuovendo tutti i pellet di cibo dalla tramoggia del cibo della gabbia domestica. Cambia i materiali della lettiera per i topi. Non rimuovere la bottiglia d'acqua.
2. Disporre il tavolo operatorio come descritto di seguito.
   1. A 1 ora prima dell'inizio del test, portare la gabbia contenente i topi in sala operatoria per riposare.
   2. Organizzare la sala operatoria durante questo periodo. Usa e contrassegna le gabbie per mouse standard in PVC trasparente come A poiché creano un ambiente familiare. Utilizzare e contrassegnare la gabbia di prova come B, che è una gabbia di scoiattolo standard in PVC trasparente. Contrassegna la gabbia comune utilizzata per posizionare i topi dopo l'esperimento come gabbia C.
   3. Copri le gabbie A e B con 3 cm di materiale da lettiera e misurale con un righello. Disporre le gabbie una accanto all'altra, con una distanza di 0,5 m tra ciascuna gabbia (Figura 1).
   4. Definire l'area sperimentale come un'area con un raggio di 2 m, con il centro che è il centro delle gabbie. Definisce l'area al di fuori dell'intervallo di 2 m come area di osservazione.
   5. Tenere la gabbia C e le gabbie contenenti topi non testati il più lontano possibile dall'area sperimentale.
3. Registrare il tempo necessario per trovare il cibo come descritto di seguito.
   1. Selezionare una posizione a caso nella gabbia B, seppellire il cibo 1 cm sotto la superficie della lettiera e lisciare la superficie della lettiera.
   2. Metti il mouse nella gabbia A per 4 minuti. Trasferisci i mouse nella gabbia B al termine del cronometraggio, accendi il dispositivo video e torna nell'area di osservazione.
   3. Quando il topo raccoglie il blocco di cibo con la zampa anteriore, interrompi la registrazione video. In alcuni casi, i topi possono essere visti mangiare con la testa china sul cibo. Questo comportamento indica anche il successo della prova, anche se il topo non tiene il cibo con la zampa anteriore.
   4. Registra i dati. Registrare il tempo trascorso dal contatto con il tappetino sul fondo della gabbia B fino a quando non è stato trovato il cibo per ogni topo. Se i topi non trovano cibo dopo 4 minuti, registrare il tempo di ricerca come tempo di ritardo di 240 s.
   5. Metti il mouse nella gabbia C dopo il test.
   6. Togliete il mangime dalla gabbia B e mettetelo in un sacchetto sigillato. Sostituisci il cibo nella gabbia B e prova il topo successivo dopo aver cambiato il materiale della lettiera, come descritto di seguito.
      1. Per i topi alloggiati nella stessa gabbia, eseguire il test con lo stesso set di materiali da lettiera nella gabbia B. Per i topi in gabbie diverse, pulire la gabbia con alcol e sostituire i materiali della lettiera.
   7. Aggiungi mangime e acqua ai topi dopo l'esperimento. Esegui l'esperimento di discriminazione sociale degli odori 1 giorno dopo.
      NOTA: Le maschere devono essere indossate durante tutto il processo e i guanti trasparenti devono essere cambiati dopo che ogni topo ha terminato l'esperimento per evitare il più possibile la croce degli odori. Mantieni l'ampiezza dei movimenti il più piccola possibile per evitare lo stress del mouse.

3. Esperimento sociale di discriminazione degli odori

1. Raccolta delle urine
   1. Raccogliere separatamente l'urina dei topi maschi sessualmente maturi e dei topi femmina e aliquotare in provette in volumi uguali¹⁹. Confezionare in provette da microcentrifuga da 2 ml con 300 μl di urina in ciascuna provetta.
   2. Conservare i campioni a -80°C fino al momento dell'uso. Agitare le provette per distribuire uniformemente il campione dopo lo scongelamento. Non scongelare e congelare ripetutamente il campione.
2. Disporre il tavolo operatorio come descritto di seguito.
   1. A 1 ora prima dell'inizio del test, portare la gabbia contenente i topi in sala operatoria per riposare.
   2. Organizzare la sala operatoria durante questo periodo come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.5.
3. Registrare il tempo di ricerca dell'urina come descritto di seguito.
   1. Praticare una scanalatura con del nastro adesivo attorno a ciascuno dei due lati larghi della gabbia B abbastanza grande da contenere la provetta da microcentrifuga contenente 300 μl di urina maschile e femminile. Posizionare i tubi e tenere chiusi i due coperchi dei tubi per ora.
   2. Metti il mouse nella gabbia A e imposta un conto alla rovescia per 4 minuti. Aprire i due tubi della gabbia B al termine della cronometraggio.
   3. Trasferire il mouse nella posizione centrale della gabbia B, alla stessa distanza dai due tubi, quindi accendere l'apparecchiatura di registrazione video e ritirarsi delicatamente e lentamente nell'area di osservazione.
   4. Quando il topo annusa la parete/bocca del tubo o anche all'interno del tubo, il tubo viene annusato con successo. A questo punto, premere il cronometro e registrare il tempo come il tempo di annusare il tubo (MS), quindi continuare a registrare il tempo di permanenza (X s) fino a quando il mouse non si allontana dal tubo.
   5. Continuate a cronometrare l'ora annusando l'altro tubo. Quando il topo annusa la parete/bocca del tubo o anche all'interno del tubo, il tubo viene annusato con successo. Premere il cronometro e registrare il tempo impiegato per annusare l'altro tubo (NS), quindi continuare a registrare il tempo di permanenza (Y s) fino a quando il mouse non si allontana dal tubo.
   6. Trasferisci il topo nella gabbia C alla fine dell'esperimento.
   7. Cambiare le provette delle urine e il materiale della lettiera della gabbia B dopo ogni test sui topi. Metti l'urina di ratto usata in un sacchetto pulito in base al sesso.
   8. Cambia i guanti e prova il mouse successivo come descritto sopra.
4. Esegui l'esperimento in un laboratorio senza odore evidente. Evita i prodotti personali che emettono odori forti. Indossare guanti e maschere durante la procedura per evitare il più possibile l'attraversamento degli odori. Mantieni l'ampiezza dei movimenti il più piccola possibile per evitare lo stress del mouse.

Risultati

Gli inquinanti ambientali inalabili compromettono la funzione olfattiva nei topi. È stato dimostrato che lo zinco atmosferico emesso dagli inceneritori e dai veicoli a motore è un inquinante inalato che può provocare infiammazione polmonare allergica²⁰. Il solfato di zinco è considerato uno dei composti tipici che causano disfunzioni olfattive²¹. Pertanto, utilizziamo il solfato di zinco come trattamento per esporre i topi mediante instillazione intranasale e test utili...

Discussione

Questo articolo introduce due protocolli fondamentali progettati per la valutazione rapida della compromissione olfattiva nei topi. Vari inquinanti ambientali inalabili provocano livelli distinti di disfunzione olfattiva nei topi. Il test del cibo sepolto viene impiegato per valutare la capacità di rilevare gli odori volatili, mentre l'esperimento di discriminazione degli odori sociali valuta la capacità dell'animale di discernere e differenziare i vari odori sociali. Il protocollo serve a valutare gli effetti tossici ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution