Untersuchung der Auswirkungen von eingeatmeten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung des Tests zur Unterscheidung von vergrabenen Lebensmitteln und des Experiments zur sozialen Geruchsunterscheidung, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber eingeatmeten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen zu bewerten.

Zusammenfassung

Riechstörungen sind ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit und sagen unabhängig das Risiko neurodegenerativer Erkrankungen voraus. Die Exposition gegenüber eingeatmeten Umweltschadstoffen kann den Geruchssinn beeinträchtigen; Dabei besteht ein dringender Bedarf an Methoden, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber eingeatmeten Umweltschadstoffen auf den Geruchssinn zu bewerten. Mäuse sind aufgrund ihres hoch entwickelten Geruchssystems und ihrer Verhaltensmerkmale ideale Modelle für Geruchsexperimente. Um die Auswirkungen der Exposition gegenüber inhalierten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen zu bewerten, wird ein detaillierter Test zur Unterscheidung von vergrabenen Lebensmitteln und ein Experiment zur sozialen Geruchsunterscheidung bereitgestellt, einschließlich der Versuchsvorbereitung, der Auswahl und des Aufbaus von Versuchsanlagen, des Testprozesses und der Zeitindizes. In der Zwischenzeit werden die Zeitmessungsausrüstung, die Betriebsdetails und die Versuchsumgebung besprochen, um den Erfolg des Assays sicherzustellen. Zinksulfat wird als Behandlung verwendet, um die Machbarkeit des experimentellen Ansatzes zu demonstrieren. Das Protokoll bietet ein einfaches und übersichtliches Verfahren zur Bewertung der Auswirkungen von inhalierten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen.

Einleitung

Riechstörungen haben sich zu einem bemerkenswerten Problem für die öffentliche Gesundheit entwickelt und sind unabhängig davon mit einem erhöhten Risiko für neurodegenerative Erkrankungen verbunden. Dieser Zustand kann sich negativ auf das allgemeine Wohlbefinden auswirken, zur Entwicklung depressiver Symptome beitragen und zu einer verminderten Lebensqualität führen. Seine Auswirkungen zeigen sich vor allem in der veränderten Wahrnehmung von Lebensmitteln, der Behinderung der sozialen Kommunikation und erhöhten negativen Gefühlen¹. Verschiedene Faktoren, darunter Sinonasalerkrankungen, Infektionen der oberen Atemwege und traumatische Hirnverletzungen, wurden als Faktoren angesehen, die zur Geruchsbeeinträchtigung beim Menschen beitragen². Insbesondere inhalierbare Umweltschadstoffe wie PM2,5, die auf 2 % bis 16 % geschätzt werden, gelangen durch die eingeatmete Luft in den Körper, durchqueren die Nasenhöhle und erreichen bestimmte geruchsbezogene Regionen, wo sie abgelagert werden 3,4,5,6,7. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass inhalierbare Umweltschadstoffe, einschließlich PM2,5 und Ammoniak, tatsächlich olfaktorische sensorische Neuronen schädigen können ^8,9,10. Es ist jedoch eine weitere Validierung erforderlich, um festzustellen, ob eine solche Schädigung direkt zu einer Riechfunktionsstörung führt. Daher ist eine sorgfältige Bewertung der Auswirkungen inhalierbarer Umweltschadstoffe auf die Riechfunktion von besonderer Bedeutung.

Derzeit wird in zahlreichen Forschungslaboratorien Mäuse als alternatives Wirbeltiermodell für Verhaltensexperimente eingesetzt, die darauf abzielen, Veränderungen der Geruchsfunktion zu verstehen 11,12,13,14. Mäuse wurden als bevorzugtes Modellsystem für die Untersuchung der chemischen Kommunikation von Wirbeltieren ausgewählt und weisen eine bemerkenswerte olfaktorische Empfindlichkeit auf, die für die Nahrungssuche und die soziale Kommunikation entscheidend ist¹⁵. Darüber hinaus hat die sich ständig weiterentwickelnde Palette von Werkzeugen zur Beobachtung und Beeinflussung des Verhaltens von Mäusen diese Spezies für die Erforschung der Geruchsfunktion außerordentlich attraktiv gemacht¹⁶.

In dieser Studie verwendeten wir den Test für vergrabene Nahrung und das Experiment zur sozialen Geruchsunterscheidung, um die olfaktorische Beeinträchtigung in einem Mausmodell zu bewerten, das inhalierbaren Umweltschadstoffen ausgesetzt war. Um die Genauigkeit der Bewertung zu erhöhen, haben wir uns für die repräsentativste Methode zur Beurteilung der Geruchsfunktion entschieden. Wir haben diese Methode systematisch weiterentwickelt, um Einfachheit und Klarheit zu gewährleisten und das Ausmaß der durch inhalierbare Umweltschadstoffe verursachten Riechstörungen effektiv beurteilen zu können.

Protokoll

Wir verwendeten männliche C57BL/6J-Mäuse (Alter: 6-8 Wochen; Gewicht: 20-22 g) für alle Verhaltenstests. Die Mäuse wurden konstanten Bedingungen ausgesetzt (d.h. Temperatur, 23 ± 1 °C; Luftfeuchtigkeit: 55 % ± 5 % und 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit eingeschaltetem Licht um 7:00 Uhr). Alle Verhaltenstests wurden zwischen 10:00 und 17:00 Uhr durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Fachkommission für Tierversuche der Universität Qingdao genehmigt. Nach einer 1-wöchigen Eingewöhnungsphase wurden alle Mäuse inhalierbaren Umweltschadstoffen ausgesetzt.

1. Exposition gegenüber Schadstoffen

1. Intranasale Verabreichung durch Instillation
   1. Inhalierbare Umweltschadstoffe in einer 0,9%igen Kochsalzlösung auflösen. Verwenden Sie einmal 5%ige Zinksulfatlösung, die nachweislich Riechstörungen verursacht¹⁷. Bei Kontrollmäusen ist 0,9 % ige normale Kochsalzlösung zu verabreichen.
   2. Anästhesieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1% Natrium-Pentobarbital¹⁸ und beurteilen Sie die Narkosetiefe mit dem Zehenkneifreflex. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit zu verhindern. Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einer geneigten Fläche, mit dem Kopf nach unten.
   3. Verabreichen Sie mit einer Pipettierpistole 10 μl der Lösung in ein Nasenloch der Maus, so dass die Lösung auf natürliche Weise in die Nasenhöhle eingeatmet werden kann.
   4. Um das Wohlbefinden der Maus zu gewährleisten und mögliche Beschwerden zu vermeiden, wiederholen Sie die Inhalation für das andere Nasenloch nach einem Intervall von 10 Minuten.
   5. 3 Tage nach der intranasalen Verabreichung durch Instillation bei Mäusen ist der Test auf vergrabene Lebensmittel durchzuführen.

2. Test auf vergrabene Lebensmittel

1. Führen Sie 18-24 Stunden vor dem Test einen Futterentzug durch, indem Sie alle Futterpellets aus dem Futterbehälter des Heimkäfigs entfernen. Wechseln Sie das Einstreumaterial für Mäuse. Entfernen Sie die Wasserflasche nicht.
2. Ordnen Sie den Operationstisch wie unten beschrieben an.
   1. 1 Stunde vor Beginn des Tests ist der Käfig mit den Mäusen zum Ausruhen in den Operationssaal zu bringen.
   2. Richten Sie den Operationssaal während dieser Zeit ein. Verwenden und kennzeichnen Sie transparente PVC-Standard-Mäusekäfige mit A, da diese eine vertraute Umgebung bilden. Verwenden und markieren Sie den Testkäfig als B, bei dem es sich um einen transparenten PVC-Standard-Käfig handelt. Markieren Sie den gemeinsamen Käfig, in dem die Mäuse nach dem Experiment platziert wurden, als Käfig C.
   3. Decken Sie die Käfige A und B mit 3 cm Einstreu ab und messen Sie diese mit einem Lineal ab. Ordnen Sie die Käfige nebeneinander an, mit einem Abstand von 0,5 m zwischen den einzelnen Käfigen (Abbildung 1).
   4. Definieren Sie den Versuchsbereich als einen Bereich mit einem Radius von 2 m, wobei der Mittelpunkt der Mittelpunkt der Käfige ist. Definieren Sie den Bereich außerhalb des Bereichs von 2 m als Beobachtungsbereich.
   5. Halten Sie Käfig C und Käfige mit ungetesteten Mäusen so weit wie möglich vom Versuchsbereich entfernt.
3. Notieren Sie die Zeit, um Nahrung zu finden, wie unten beschrieben.
   1. Wählen Sie eine zufällige Position in Käfig B, vergraben Sie das Futter 1 cm unter der Oberfläche der Einstreu und glätten Sie die Oberfläche der Einstreu.
   2. Setzen Sie die Maus für 4 Minuten in Käfig A. Bringen Sie die Mäuse am Ende der Zeitmessung in Käfig B, schalten Sie das Videogerät ein und kehren Sie in den Beobachtungsbereich zurück.
   3. Wenn die Maus den Nahrungsblock mit der Vorderpfote aufnimmt, stoppt sie die Videoaufnahme. In einigen Fällen kann man Mäuse sehen, die mit dem Kopf über das Futter gebeugt fressen. Auch dieses Verhalten deutet auf einen Versuchserfolg hin, auch wenn die Maus das Futter nicht mit der Vorderpfote hält.
   4. Daten aufzeichnen. Notieren Sie die Zeit vom Kontakt mit der Matte am Boden von Käfig B bis zur Nahrungssuche für jede Maus. Wenn die Mäuse nach 4 min kein Futter finden, notieren Sie die Fundzeit als Verzögerungszeit von 240 s.
   5. Setzen Sie die Maus nach dem Test in Käfig C ein.
   6. Nehmen Sie das Futter aus Käfig B und geben Sie es in einen versiegelten Beutel. Setzen Sie das Futter in Käfig B zurück und testen Sie die nächste Maus nach dem Wechsel des Einstreumaterials, wie unten beschrieben.
      1. Bei Mäusen, die im selben Käfig gehalten sind, testen Sie mit dem gleichen Satz Einstreumaterialien in Käfig B. Bei Mäusen in verschiedenen Käfigen reinigen Sie den Käfig mit Alkohol und ersetzen Sie das Einstreumaterial.
   7. Geben Sie den Mäusen nach dem Experiment Futter und Wasser. Führen Sie das Experiment zur sozialen Geruchsunterscheidung 1 Tag später durch.
      HINWEIS: Während des gesamten Prozesses müssen Masken getragen werden, und durchsichtige Handschuhe müssen nach Beendigung des Experiments mit jeder Maus gewechselt werden, um Geruchsvermischung so weit wie möglich zu vermeiden. Halten Sie die Amplitude der Bewegungen so klein wie möglich, um Stress für die Maus zu vermeiden.

3. Experiment zur Unterscheidung von Gerüchen in sozialer Atmosphäre

1. Sammlung von Urin
   1. Der Urin von geschlechtsreifen männlichen und weiblichen Mäusen wird getrennt gesammelt und in gleichen Volumina in Röhrchen aliquotiert¹⁹. In 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μl Urin in jedem Röhrchen verpacken.
   2. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80°C. Schütteln Sie die Röhrchen, um die Probe nach dem Auftauen gleichmäßig zu verteilen. Tauen Sie die Probe nicht wiederholt auf und frieren Sie sie nicht ein.
2. Ordnen Sie den Operationstisch wie unten beschrieben an.
   1. 1 Stunde vor Beginn des Tests ist der Käfig mit den Mäusen zum Ausruhen in den Operationssaal zu bringen.
   2. Richten Sie den Operationssaal während dieser Zeit wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.5 beschrieben ein.
3. Notieren Sie die Zeit, um Urin zu finden, wie unten beschrieben.
   1. Machen Sie mit Klebeband eine Rille um jede der beiden breiten Seiten des Käfigs B, die groß genug ist, um das Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μl männlichem und weiblichem Urin aufzunehmen. Platzieren Sie die Schläuche und halten Sie die beiden Röhrenabdeckungen vorerst geschlossen.
   2. Setzen Sie die Maus in Käfig A und stellen Sie einen Countdown von 4 Minuten ein. Öffnen Sie die beiden Röhrchen von Käfig B am Ende der Zeit.
   3. Bringen Sie die Maus in die mittlere Position von Käfig B, im gleichen Abstand zu den beiden Röhren, schalten Sie dann das Videoaufzeichnungsgerät ein und ziehen Sie sich sanft und langsam in den Beobachtungsbereich zurück.
   4. Wenn die Maus an der Röhrenwand/dem Mund oder sogar im Inneren der Röhre schnüffelt, wird die Röhre erfolgreich gerochen. Drücken Sie zu diesem Zeitpunkt die Stoppuhr und notieren Sie die Zeit als Zeit des Riechens an der Röhre (M s), und fahren Sie dann mit der Aufzeichnung der Verweilzeit (X s) fort, bis sich die Maus von der Röhre entfernt.
   5. Fahren Sie mit der Zeitmessung fort, indem Sie an der anderen Röhre schnüffeln. Wenn die Maus an der Röhrenwand/dem Mund oder sogar im Inneren der Röhre schnüffelt, wird die Röhre erfolgreich gerochen. Drücken Sie die Stoppuhr und notieren Sie die Zeit, die es benötigt hat, um an der anderen Röhre zu riechen (N s), und fahren Sie dann mit der Aufzeichnung der Verweilzeit (Y s) fort, bis sich die Maus von der Röhre entfernt.
   6. Übertragen Sie die Maus am Ende des Experiments in Käfig C.
   7. Wechseln Sie die Urinschläuche und das Einstreumaterial von Käfig B nach jedem Maustest. Geben Sie den gebrauchten Rattenurin je nach Geschlecht in einen sauberen Beutel.
   8. Wechseln Sie die Handschuhe und testen Sie die nächste Maus wie oben beschrieben.
4. Führen Sie das Experiment in einem Labor ohne offensichtlichen Geruch durch. Vermeiden Sie persönliche Produkte, die starke Gerüche abgeben. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und Masken, um Gerüche so weit wie möglich zu vermeiden. Halten Sie die Amplitude der Bewegungen so klein wie möglich, um Stress für die Maus zu vermeiden.

Ergebnisse

Einatembare Umweltschadstoffe beeinträchtigen die Riechfunktion von Mäusen. Es hat sich gezeigt, dass atmosphärisches Zink, das aus Verbrennungsanlagen und Kraftfahrzeugen freigesetzt wird, ein eingeatmeter Schadstoff ist, der zu allergischen Lungenentzündungen führen kann²⁰. Zinksulfat gilt als eine der typischen Verbindungen, die eine Geruchsstörung verursachen²¹. Daher verwenden wir Zinksulfat als Behandlung, um Mäuse durch intranasale Instillation zu exponieren, ...

Diskussion

In diesem Artikel werden zwei grundlegende Protokolle vorgestellt, die für die schnelle Beurteilung von Geruchsstörungen bei Mäusen entwickelt wurden. Unterschiedliche inhalierbare Umweltschadstoffe führen bei Mäusen zu einer ausgeprägten Geruchsstörung. Der Test der vergrabenen Nahrung wird eingesetzt, um die Fähigkeit zur Erkennung flüchtiger Gerüche zu beurteilen, während das Experiment zur sozialen Geruchsunterscheidung die Fähigkeit des Tieres bewertet, verschiedene soziale Gerüche zu erkennen und zu un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution