Estudando os efeitos de poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos

Resumo

Este artigo fornece uma descrição detalhada do teste de alimentos enterrados e do experimento de discriminação de odor social para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos.

Resumo

O comprometimento olfatório é um problema significativo de saúde pública e prediz de forma independente o risco de doenças neurodegenerativas. A exposição a poluentes ambientais inalados pode prejudicar o olfato; Assim, há uma necessidade urgente de métodos para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados sobre o olfato. Os camundongos são modelos ideais para experimentos olfativos devido ao seu sistema olfativo altamente desenvolvido e características comportamentais. Para avaliar os efeitos da exposição a poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos, é fornecido um teste detalhado de alimentos enterrados e um experimento de discriminação de odor social, incluindo a preparação do experimento, a seleção e construção de instalações experimentais, o processo de teste e índices de tempo. Enquanto isso, equipamentos de cronometragem, detalhes operacionais e o ambiente experimental são discutidos para garantir o sucesso do ensaio. O sulfato de zinco é usado como tratamento para demonstrar a viabilidade da abordagem experimental. O protocolo fornece um processo operacional simples e claro para avaliar os efeitos dos poluentes ambientais inalados na função olfativa em camundongos.

Introdução

O comprometimento olfatório emergiu como uma preocupação de saúde pública notável e está independentemente associado a um risco aumentado de doenças neurodegenerativas. Essa condição pode afetar adversamente o bem-estar geral, contribuir para o desenvolvimento de sintomas depressivos e resultar em uma diminuição da qualidade de vida. Seu impacto é observado de forma proeminente na percepção alterada da comida, impedimento na comunicação social e aumento de sentimentos negativos¹. Vários fatores, incluindo doença nasossinusal, infecção do trato respiratório superior e lesão cerebral traumática, têm sido considerados contribuintes para o comprometimento olfativo em humanos². Notavelmente, poluentes ambientais inaláveis, como PM2.5, estimados em 2% a 16%, entram no corpo através do ar inspirado, atravessam a cavidade nasal e atingem regiões específicas dedicadas ao olfato, onde são depositados 3,4,5,6,7. Descobertas recentes indicam que poluentes ambientais inaláveis, incluindo PM2.5 e amônia, podem de fato prejudicar os neurônios sensoriais olfativos ^8,9,10. No entanto, é necessária uma validação adicional para verificar se esse dano leva diretamente à disfunção olfativa. Portanto, uma avaliação meticulosa dos efeitos dos poluentes ambientais inaláveis na função olfativa é de particular importância.

Atualmente, vários laboratórios de pesquisa empregam camundongos como um modelo alternativo de vertebrados para experimentos comportamentais destinados a compreender mudanças na função olfativa^{11 , 12 , 13 , 14} . Os camundongos foram escolhidos como o sistema modelo preferido para investigar a comunicação química dos vertebrados e exibem uma notável sensibilidade olfativa crucial para o forrageamento e a comunicação social¹⁵. Além disso, a variedade de ferramentas em constante evolução para observar e influenciar o comportamento do camundongo tornou esta espécie excepcionalmente atraente para pesquisas sobre a função olfativa¹⁶.

Neste estudo, empregamos o teste de alimentos enterrados e o experimento de discriminação de odor social para avaliar o comprometimento olfativo em um modelo de camundongo exposto a poluentes ambientais inaláveis. Para aumentar a precisão da avaliação, optou-se pelo método mais representativo para avaliar a função olfativa. Refinamos sistematicamente esse método para garantir simplicidade e clareza, permitindo-nos avaliar a extensão da disfunção olfativa induzida por poluentes ambientais inaláveis de forma eficaz.

Protocolo

Foram utilizados camundongos C57BL/6J machos (idade: 6-8 semanas; peso: 20-22 g) para todos os testes comportamentais. Os camundongos foram submetidos a condições estacionárias (ou seja, temperatura, 23 ± 1 °C; umidade, 55% ± 5% e ciclo claro-escuro de 12/12 h com luzes acesas às 7:00). Todos os testes comportamentais foram realizados entre 10:00 e 17:00. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê Profissional de Experimentos com Animais da Universidade de Qingdao. Após um período de aclimatação de 1 semana, todos os camundongos foram expostos a poluentes ambientais inaláveis.

1. Exposição a poluentes

1. Administração intranasal por instilação
   1. Dissolva os poluentes ambientais inaláveis em uma solução salina a 0,9%. Use solução de sulfato de zinco a 5% uma vez, o que demonstrou causar disfunção olfativa¹⁷. Para camundongos controle, administre solução salina normal a 0,9%.
   2. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1^{% 18} e avaliar a profundidade da anestesia usando o reflexo de pinça do dedo do pé. Aplique pomada veterinária nos olhos do rato para evitar o ressecamento. Posicione o mouse de costas em uma superfície inclinada, com a cabeça voltada para baixo.
   3. Usando uma pistola de pipetagem, administre 10 μL da solução em uma narina do camundongo, permitindo inalar naturalmente a solução para a cavidade nasal.
   4. Para garantir o bem-estar do camundongo e evitar qualquer desconforto potencial, repita a inalação para a outra narina após um intervalo de 10 minutos.
   5. Aos 3 dias após a administração intranasal por instilação em camundongos, realize o teste de alimentos enterrados.

2. Teste de alimentos enterrados

1. Realize a privação de alimentos 18-24 h antes do teste, removendo todos os pellets de ração do funil de alimentos da gaiola doméstica. Troque os materiais de cama para ratos. Não remova a garrafa de água.
2. Disponha a mesa de operação conforme descrito abaixo.
   1. 1 h antes do início do teste, leve a gaiola contendo os camundongos para a sala de cirurgia para descansar.
   2. Organize a sala de cirurgia durante este período. Use e marque gaiolas de mouse padrão de PVC transparente como A, pois elas criam um ambiente familiar. Use e marque a gaiola de teste como B, que é uma gaiola de esquilo padrão de PVC transparente. Marque a gaiola comum usada para colocar os camundongos após o experimento como gaiola C.
   3. Cubra as gaiolas A e B com 3 cm de material de cama e meça-as com uma régua. Disponha as gaiolas lado a lado, com uma distância de 0,5 m entre cada gaiola (Figura 1).
   4. Defina a área experimental como uma área com raio de 2 m, sendo o centro o centro das gaiolas. Defina a área fora do alcance de 2 m como a área de observação.
   5. Mantenha a gaiola C e as gaiolas contendo camundongos não testados o mais longe possível da área experimental.
3. Registre o tempo para encontrar comida conforme descrito abaixo.
   1. Selecione uma posição aleatoriamente na gaiola B, enterre a comida 1 cm abaixo da superfície da cama e alise a superfície da cama.
   2. Coloque o mouse na gaiola A por 4 min. Transfira os mouses para a gaiola B no final do tempo, ligue o dispositivo de vídeo e retorne à área de observação.
   3. Quando o mouse pegar o bloco de comida com a pata dianteira, pare a gravação do vídeo. Em alguns casos, os ratos podem ser vistos comendo com a cabeça inclinada sobre a comida. Esse comportamento também indica sucesso na tentativa, mesmo que o camundongo não esteja segurando a comida com a pata dianteira.
   4. Registre dados. Registre o tempo desde o contato com o tapete na parte inferior da gaiola B até que o alimento seja encontrado para cada camundongo. Se os ratos não encontrarem comida após 4 minutos, registre o tempo de descoberta como um tempo de atraso de 240 s.
   5. Coloque o mouse na gaiola C após o teste.
   6. Retire a ração da gaiola B e coloque-a em um saco lacrado. Substitua a comida na gaiola B e teste o próximo mouse após trocar o material da cama, conforme descrito abaixo.
      1. Para os ratinhos alojados na mesma gaiola, testar com o mesmo conjunto de materiais de cama na gaiola B. Para ratos em gaiolas diferentes, limpe a gaiola com álcool e substitua os materiais de cama.
   7. Adicione ração e água aos ratos após o experimento. Realize o experimento de discriminação de odor social 1 dia depois.
      NOTA: As máscaras precisam ser usadas durante todo o processo e as luvas transparentes precisam ser trocadas após cada mouse terminar o experimento para evitar o odor cruzado o máximo possível. Mantenha a amplitude dos movimentos o menor possível para evitar o estresse do mouse.

3. Experiência social da discriminação do odor

1. Coleta de urina
   1. Colete separadamente a urina de camundongos machos e camundongos fêmeas sexualmente maduros e alíquota em tubos em volumes iguais¹⁹. Embalar em tubos de microcentrífuga de 2 mL com 300 μL de urina em cada tubo.
   2. Armazene as amostras a -80 ° C até o uso. Agite os tubos para distribuir uniformemente a amostra após o descongelamento. Não descongele e congele a amostra repetidamente.
2. Disponha a mesa de operação conforme descrito abaixo.
   1. 1 h antes do início do teste, leve a gaiola contendo os camundongos para a sala de cirurgia para descansar.
   2. Organize a sala de cirurgia durante este período, conforme descrito nas etapas 2.2.2-2.2.5.
3. Registre o tempo para encontrar a urina conforme descrito abaixo.
   1. Faça uma ranhura com fita adesiva ao redor de cada um dos dois lados largos da gaiola B grande o suficiente para conter o tubo de microcentrífuga contendo 300 μL de urina masculina e feminina. Coloque os tubos e mantenha as duas tampas dos tubos fechadas por enquanto.
   2. Coloque o mouse na gaiola A e defina uma contagem regressiva para 4 min. Abra os dois tubos da gaiola B no final do intervalo.
   3. Transfira o mouse para a posição central da gaiola B, à mesma distância dos dois tubos, ligue o equipamento de gravação de vídeo e recue suave e lentamente para a área de observação.
   4. Quando o rato cheira a parede/boca do tubo ou mesmo dentro do tubo, o tubo é cheirado com sucesso. Neste momento, pressione o cronômetro e registre a hora como a hora de cheirar o tubo (M s), depois continue a registrar o tempo de residência (X s) até que o mouse se afaste do tubo.
   5. Continue cronometrando o tempo cheirando o outro tubo. Quando o rato cheira a parede/boca do tubo ou mesmo dentro do tubo, o tubo é cheirado com sucesso. Pressione o cronômetro e registre o tempo que levou para cheirar o outro tubo (N s) e, em seguida, continue a registrar o tempo de residência (Y s) até que o mouse se afaste do tubo.
   6. Transfira o mouse para a gaiola C no final do experimento.
   7. Troque os tubos de urina e o material de cama da gaiola B após cada teste com camundongos. Coloque a urina de rato usada em um saco limpo de acordo com o sexo.
   8. Troque as luvas e teste o próximo mouse conforme descrito acima.
4. Realize o experimento em um laboratório sem odor óbvio. Evite produtos pessoais que emitam odores fortes. Use luvas e máscaras durante todo o procedimento para evitar ao máximo a passagem de odores. Mantenha a amplitude dos movimentos o menor possível para evitar o estresse do mouse.

Resultados

Poluentes ambientais inaláveis prejudicam a função olfativa em camundongos. O zinco atmosférico emitido por incineradores e veículos motorizados demonstrou ser um poluente inalado que pode resultar em inflamação pulmonar alérgica²⁰. O sulfato de zinco é considerado um dos compostos típicos que causam disfunção olfativa²¹. Portanto, usamos sulfato de zinco como tratamento para expor camundongos por instilação intranasal e testamos usando o teste de comida enter...

Discussão

Este artigo apresenta dois protocolos fundamentais projetados para a avaliação rápida do comprometimento olfativo em camundongos. Poluentes ambientais inaláveis variados resultam em níveis distintos de disfunção olfativa em camundongos. O teste de alimentos enterrados é empregado para avaliar a capacidade de detectar odores voláteis, enquanto o experimento de discriminação de odores sociais avalia a capacidade do animal de discernir e diferenciar vários odores sociais. O protocolo aqui serve para avaliar os e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL  adjustable micropipette	Eppendorf, Germany	3123000225	Intranasal instillation
0.9% saline solution	Solarbio	7647-14-5	Dissolve pollutants
Anhydrous zinc sulfate	Macklin	7733-02-0	Expose mice
Centrifuge tube (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Place urine
Electronic balance	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Weight anesthetics and pollutants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	statistic analysis
Handheld Dust detector	TSI Incorporated	DuatTrak 8532	Inhalation-exposed mice
Video recording equipment	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	The activity time of mice was recorded
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5	Mix solution