Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يساعد تقييم الاختلافات التشريحية بين المقاطع العرضية للأوراق C3 و C4 على فهم كفاءة التمثيل الضوئي. تصف هذه الورقة تحضير وفحص المقاطع العرضية للأوراق الحرة وشبه الرقيقة ، جنبا إلى جنب مع المحاذير في التحضير لأنواع المحاصيل Triticum aestivum و Zea mays.

Abstract

تنشأ الكفاءة المعززة لعملية التمثيل الضوئي C4 ، مقارنة بآلية C3 ، من قدرتها على تركيز CO2 في خلايا غلاف الحزمة. ترتبط فعالية التمثيل الضوئي C4 وكفاءة استخدام المياه الجوهرية ارتباطا مباشرا بحصة خلايا الميزوفيل وأوراق الحزمة ، وحجم وكثافة أغلفة الحزمة ، وحجم وكثافة وسمك جدار الخلية لخلايا غلاف الحزمة. يمكن إجراء التحليل المجهري السريع لهذه السمات على أقسام اليد الحرة وشبه الرقيقة باستخدام المجهر الضوئي التقليدي ، مما يوفر معلومات قيمة حول كفاءة التمثيل الضوئي في محاصيل C4 عن طريق تحديد وفحص أنواع معينة من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض الأخطاء في إعداد المقطع الحر وشبه الرقيق التي تؤثر على القياسات التشريحية وتشخيصات نوع الخلية ، وكذلك كيفية تجنب هذه الأخطاء. يوفر هذا النهج المجهري وسيلة فعالة لجمع الأفكار حول تأقلم التمثيل الضوئي مع التباين البيئي ويساعد في الفحص السريع للمحاصيل للمناخات المستقبلية.

Introduction

التمثيل الضوئي هو عملية أساسية حيث يتم تحويل الطاقة الضوئية إلى طاقة كيميائية ، بمثابة حجر الزاوية في الشبكات الغذائية الأرضية. تتبع معظم النباتات مسار C3 لعملية البناء الضوئي؛ حيث يكون ناتج البناء الضوئي الأساسي هو مركب الجليسرات 3-فوسفات ثلاثي الكربون. تطور التمثيل الضوئي C3 منذ أكثر من ملياري سنة في الغلاف الجوي بكثرة في CO2 ومنخفضة في O21. إنزيم التمثيل الضوئي الرئيسي ريبولوز 1,5 ثنائي فوسفات كربوكسيلاز / أكسجيناز (روبيسكو) ، الذي تطور في ظل هذه الظروف ، هو دون المستوى الأمثللظروف O 2 المنخفضة الحالية المنخفضة CO 2 حيث يتفاعل بشكل تنافسي مع O2 ، مما يؤدي إلى بدء التنفس الضوئي2. التنفس الضوئي هو مسار مهدر يستهلك الطاقة بدلا من إنتاجها وإطلاق CO2 كمنتج ثانوي. وبالتالي ، من الأهمية بمكان الحفاظ على تركيز عال من CO2 حول Rubisco في البلاستيدات الخضراء لمنع الأوكسجين 3,4. نظرا لعدم قدرة نباتات C3 على تركيز CO2 ، هناك انخفاض كبير في CO2 من الهواء المحيط إلى البلاستيدات الخضراء ، مما يحد من التمثيل الضوئي ويؤثر على نمو النبات وإنتاج الكتلة الحيوية2،5،6.

في نباتات C3 ، يكون التمثيل الضوئي محدودا بدخول CO2 من خلال الثغور ، وانتشاره عبر الميزوفيل ، والنشاط الكيميائي الحيوي لإنزيمات التمثيل الضوئي. يقتصر دخول CO2 أولا على التوصيل الثغري ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة الظروف البيئية مثل درجة حرارة الهواء والرطوبة. ثم ينتشر CO2 عبر المرحلة الغازية والسائلة الداخلية للورقة إلى Rubisco7. في نباتات C3 ، تحدث جميع مراحل البناء الضوئي في البلاستيدات الخضراء لخلايا الميزوفيل ، وتحتاج النباتات إلى الحفاظ على تدفق مستمر ل CO2 من الغلاف الجوي إلى البلاستيدات الخضراء. إن اعتماد توافر CO2 في البلاستيدات الخضراء على انفتاح الثغور ، وبنية الميزوفيل ، وخصائص الخلايا الفردية والبلاستيدات الخضراء يترك النباتات عرضة للقيود البيئية التي تؤثر في النهاية على التمثيل الضوئي ، مثل انخفاض توافر المياه وارتفاع درجات الحرارة7،8،9،10 ، مما يسلط الضوء بشكل خاص على ضعفها أمام ظروف تغير المناخ11.

بالنظر إلى التحديات التي يفرضها عدم كفاءة مسار C3 ، بالإضافة إلى القيود المفروضة على الحفاظ على مستويات CO2 المثلى والتعرض للعوامل البيئية ، في بعض النباتات ، تطور مسار آخر ، مسار التمثيل الضوئي C4 . بشكل مميز ، تحتوي نباتات C4 على مسارين كيميائيين حيويين منفصلين مكانيا. يحدث التثبيت الأولي لثاني أكسيد الكربون2 في خلايا الميزوفيل بواسطة كربوكسيلاز الفوسفوينول بيروفات ، الذي لديه تقارب أعلى ل CO2 من روبيسكو ويفتقر أيضا إلى نشاط الأكسجين. يتم نقل منتج C4 المشكل إلى خلايا غمد الحزمة ، حيث يتم نزع الكربوكسيل منه، ويتم إطلاق ثاني أكسيد الكربون 2 مرة أخرى وتثبيته بواسطة Rubisco (التمثيل الضوئي C3 ) 12،13،14. يسمح التقارب الأكبر لكربوكسيلاز PEP ب CO2 والجدران الخلوية السميكة لخلايا غلاف الحزمة بتركيز CO2 في خلايا غلاف الحزمة ، وبالتالي ، تقلل نباتات C4 من التنفس الضوئي عن طريق الفصل المكاني لتثبيت CO2 ودورة كالفن. يعرض اعتماد مسار C4 استجابة الطبيعة التكيفية للقيود البيئية ، ويقدم رؤى حول الاستراتيجيات المحتملة لتحسين إنتاجية المحاصيل ومرونتها في الظروف المناخيةالمتغيرة 15.

يتميز التشريح المتخصص لبنية الأوراق في نباتات C4 بأوردة محاطة بخلايا مغلفة حزمة وعائية متضخمة تحتوي على بلاستيدات خضراء وبترتيب شعاعي لخلايا الميزوفيل في حلقة خارجية حول خلايا غلاف الحزمة. تقع خلايا الميزوفيل على مقربة من خلايا غلاف الحزمة ، مما يتيح النقل السريع والمستمر للمستقلبات بين نوعي الخلايا. ترتيب هذه الخلية نموذجي لنباتات C4 ويشار إليه باسم تشريح كرانز16. في الأنواع C3 ، يمكن أن يختلف تخصص خلايا الميزوفيل والتخلص منها ، لكن خلايا الغلاف الحزمي أصغر بشكل واضح وتحتوي على عدد قليل من البلاستيدات الخضراء أو لا تحتوي على بلاستيدات خضراء على الإطلاق. يسمح تشريح كرانز المحدد بتركيز CO2 في البلاستيدات الخضراء في خلايا غلاف الحزمة حيث يوجد إنزيم C 3-carboxyylating Rubisco ، مما يعيق بشكل فعال التنفس الضوئي4،17،18. على الرغم من ترتيبها المعقد على ما يبدو ، فقد حدثت هذه التغييرات بشكل مستقل عدة مرات في تطور كاسيات البذور ، مما يشير إلى أنه مسار تطوري ممكن نسبيا19،20،21 ، وقد ثبت أن الأصناف المختلفة في مرحلة متوسطة بين استقلاب الكربون C3 و C4 ، المشار إليه باسم C3-C 4 أو C2 ، امتلاك القدرة على التركيز وإعادة استيعاب CO222،23،24،25.

العديد من نباتات C4 هي محاصيل ذات أهمية اقتصادية عالية ، وكانت الهندسة الوراثية لمحاصيل C3 ، مثل الأرز ، لتحسين قدرتها على التكيف مع المناخ وتأمين المحصول موضوعا مثيرا للاهتمام في العقودالماضية 26,27. ومع ذلك ، فإن الجهود الهندسية تدعو إلى فهم مفصل للتشريح المتخصص C4 وكيف يتحكم في التمثيل الضوئي 2,28.

يعد إنشاء تشريح C4 Kranz شرطا أساسيا لتحقيق الهدف الطموح المتمثل في هندسة التمثيل الضوئي C4 إلى محاصيل C3 25. ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لتنظيم تشريح كرانز وطرق الفحص السريع لسماته التشريحية الرئيسية محدود ، مما يجعل من الصعب تحديد الأنواع الهجينة. أظهرت الدراسات السابقة أن السمات الرئيسية التي تنظم كفاءة التمثيل الضوئي في نباتات C3 و C4 تشمل المسافة بين الأوردة ، وقطر مجمع غلاف الحزمة ، وحجم خلايا غلاف الحزمة14,29. يمكن فحص هذه السمات بسهولة باستخدام أقسام اليد الحرة وتحليلها كميا باستخدام أقسام شبه رقيقة. هنا ، نصف طريقة تقييم السمات التي تسمح بتشخيص التمايز التشريحي C3 و C4 من خلال الفحص المجهري المتقاطع والضوئي ، أي منطقة غمد الحزمة ، والمسافة بين الأوردة ، وتردد الوريد.

Protocol

1. ظروف نمو النبات

  1. حدد القمح (Triticum aestivum L. Var. القمح الشتوي ، "فريديس") والذرة (Zea mays L. Var. Saccharata ، "Golden Bantam") كنباتات تمثيلية C3 و C4 ، على التوالي. قم بزراعة كلا النوعين النباتيين في غرفة نمو يتم التحكم فيها بيئيا من البذور.
  2. حافظ على الرطوبة النسبية عند 55٪ مع درجة حرارة الهواء عند 25 درجة مئوية / 18 درجة مئوية (ليلا / نهارا) مع فترة إضاءة تبلغ 12 ساعة. الحفاظ على كثافة تدفق الفوتون الضوئي (Q) على سطح النبات عند 1200 μmol / m2 / s لتمثيل ظروف نموها الطبيعية. تنمو جميع النباتات في تركيز CO2 المحيط من 400 μmol / mol.
  3. سقي النباتاتكل يوم 2 بالماء المقطر وخصب بمحلول Hoagland بعد 10 أيام من ظهور الشتلات. قم بزراعة النباتات في الظروف المحددة لمدة 60 يوما واستخدم الأوراق الموسعة بالكامل للتحليلات المجهرية.

2. إعداد وعرض الأقسام اليدوية

  1. اختر 3 أوراق ناضجة غير شيخوخة من كل نبات واحتفظ بها في الماء المقطر. باستخدام شفرة حلاقة جديدة من جانب واحد ، قم بعمل قطع تسوية واحد لتشكيل زاوية قائمة مع سطح الورقة للتأكد من أن المقاطع عبارة عن مقاطع عرضية عرضية متعامدة مع سطح الورقة.
  2. ضع عينة الورقة على طبق زجاجي على قطعة من شمع الأسنان لتثبيت العينة وتجنب الانزلاق. اقطع عن طريق تحريك الشفرة لأسفل مباشرة على عينة الورقة لقطعها بشكل نظيف عبر الخلايا. الحفاظ على المقاطع العرضية في الماء المقطر.
  3. قم بتركيب العينات على شريحة زجاجية عن طريق وضعها على قطرة ماء وتغطيتها بغطاء زجاجي للعرض والتصوير المجهري. تجنب حبس فقاعات الهواء.
  4. اعرض الشريحة تحت مجهر ضوئي مركب بتكبير 10x و 20x. احفظ الصور وفقا لدليل البرنامج ، جنبا إلى جنب مع المقياس ذي الصلة.

3. تحضير المقاطع شبه الرقيقة

  1. قطع مقاطع بحجم 3 مم × 5 مم تقريبا من المناطق الوربية جنبا إلى جنب مع الضلع الأوسط من الأوراق من كل من Z. mays و T. aestivum على طبق زجاجي كما في الخطوة 2.2. تأكد من أن طول القسم المقطوع يمتد على طول حبة الورقة.
  2. ضع المادة النباتية في حقنة مع 1 مل من محلول التثبيت (4٪ ألدهيد جلوتاريك في 0.1 متر عازلة فوسفات ، درجة الحموضة = 6.9 ، الجدول 1).
  3. امسك المحقنة عموديا ، وأزل الهواء ، وأمسك إصبعك على الحافة ، وضخ المحقنة لإنشاء فراغ. كرر حتى تقع العينات في الجزء السفلي من المحقنة ، مما يشير إلى التسلل الناجح.
  4. انقل محتويات المحقنة إلى قنينة زجاجية عليها علامة واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة قبل الخطوة التالية (الجدول 2).
  5. لكل قارورة ، قم بإزالة المثبت برفق باستخدام ماصة وأضف المخزن المؤقت للفوسفات حتى يتم تغطية العينة. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3x.
  6. قم بإزالة المخزن المؤقت للفوسفات باستخدام ماصة وأضف رابع أكسيد الأوزميوم (ALERT) حتى يتم تغطية العينة. سوف تتحول العينات والمواد العضوية الأخرى إلى اللون الأسود. استخدم قفازات مزدوجة. اترك لمدة 1 ساعة.
  7. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بالماء المقطر. اتركيه لمدة 30 دقيقة كرر هذه الخطوة 3x واستخدم قفازات مزدوجة.
  8. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول الإيثانول بالماء المقطر 50/50. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع محاليل الإيثانول بالماء المقطر في السلسلة التالية: 30/70 و 20/80 و 10/90 و 2x عند 100٪ إيثانول. يمكن ترك العينات في أي من هذه المحاليل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول راتنج إيثانول. ضع العينات على طبق الخلاط واتركها لمدة 2 ساعة. كرر هذه الخطوة مع محاليل راتنج الإيثانول في السلسلة التالية: 1/2 و 1/1 و 2/1 و 3/1 و 2x عند راتنج 100٪. يمكن ترك العينات في أي من هذه المحاليل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. قم بتغطية تجاويف قالب التضمين المسطح (16 تجويفا ، أبعاد التجويف: 14 لترا × 4.8 عرض × 3 عمق (مم)) براتنج 100٪ وضع العينات على أحد طرفي التجويف. قم بإعداد ملصقات ورقية مكتوبة بالقلم الرصاص لكل عينة وضعها على الطرف الآخر من التجويف.
  11. املأ جميع التجاويف بالكامل براتنج 100٪ وقم بتصويب العينات والملصقات إذا تحركت. قم بتغطية القالب بغشاء التضمين والبلمرة في الفرن وفقا لإرشادات منتج راتنج الأكريليك.
  12. اضبط الكتلة المبلمرة مع العينة في حامل العينة من ultramicrotome. قم بقص الكتلة باستخدام سكين زجاجي خشن حتى يصبح النسيج مرئيا ويتم التخلص من الراتنج الزائد.
  13. قطع المقاطع شبه الرقيقة بشكل عرضي (1 ميكرومتر) باستخدام سكين زجاجي أو ماسي. اجمع المقاطع باستخدام حلقة تلقيح معدنية من سطح الماء وضعها على شريحة زجاجية. جفف الشريحة على طبق ساخن (60 درجة مئوية) لتثبيت الأقسام على الزجاج.
  14. قم بتلطيخ الأجزاء الثابتة باللون الأزرق التولويدين (محلول مائي 1٪) لمدة 5 ثوان قبل شطفها بالماء المقطر وتجفيفها مرة أخرى على اللوح الساخن.
    ملاحظة: تأكد من إجراء عملية التثبيت الكيميائي تحت غطاء الدخان. يجب استبدال السكاكين الزجاجية بشكل دوري لضمان الجروح الحادة التي تسمح بأقسام بدون تمزق أو تشوهات.

4. تصوير العينات

  1. تصوير مقاطع الأوراق الطازجة
    1. قم بإعداد المجهر الضوئي المركب مع البرنامج المصاحب وفقا للدليل.
    2. ضع الشريحة الزجاجية على المسرح. اضبط العدسة واعرض القسم بمعدل 10 أضعاف للحصول على نظرة عامة ، ثم عند أهداف 20x و 40x.
    3. في كل هدف ، انتقل إلى القناة المباشرة ، وركز على منطقة الاهتمام ، وحدد موقع خلايا غلاف الحزمة حول الوريد.
    4. بمجرد التركيز ، انقر فوق تجميد زر وإضافة المقياس بالضغط على شريط المقياس زر في أدوات التبويب. احفظ الصورة في . تنسيق TIF لتحليل الصور.
  2. تصوير المقاطع المخترقة بالراتنج
    1. قم بإعداد المجهر الضوئي الآلي فيما يتعلق بالبرنامج المصاحب على الكمبيوتر.
    2. قم بتحميل القناة الشفافة ووضع الشريحة على مرحلة المجهر. ركز على القسم باستخدام تكبير موضوعي 40x واضبط السطوع لضمان رؤية جميع هياكل الخلايا.
    3. اضبط منطقة موقع القسم باستخدام وظيفة المتصفح للتأكد من تصوير القسم بأكمله وانقر فوق الزر غرزة .
    4. انقر فوق تم ثم ابدأ للسماح للمجهر بتصوير القسم بأكمله. افتح برنامج تحليل الصور وافتح البلاط الذي تم التقاطه بواسطة المجهر.
    5. باستخدام ميزة Align ، تأكد من عدم تداخل البلاطات. بعد إنشاء الصورة ، اضبط الموضع والسطوع والتدوير باستخدام علامة التبويب ضبط.
    6. اطبع المقياس على الصورة قبل الحفظ في . تنسيق TIF.
  3. القياسات التشريحية باستخدام برنامج ImageJ
    1. افتح برنامج ImageJ وقم بتحميل الصورة عن طريق سحبها إلى النافذة.
    2. باستخدام أداة الخط، قم بمعايرة المقياس كما يلي: ارسم خطا فوق شريط المقياس، اختر تحليل > ضبط المقياس، قم بتغيير المسافة المعروفة إلى طول شريط المقياس، وقم بتغيير وحدة الطول إلى الوحدة الصحيحة.
    3. قم بقياس السمة المحتملة عن طريق تحديد أداة الخط ، ورسم خط عبر منطقة الاهتمام ، والضغط على المفتاح M .
    4. لقياسات المساحة، حدد أداة تحديد المضلع وارسم حول النسيج محل الاهتمام. اختتم بالضغط على المفتاح M . تظهر القياسات كنافذة منبثقة ، والتي يمكن نسخها إلى جدول بيانات لمزيد من تحليل البيانات.

النتائج

يوضح الشكل 1 أ الاتجاه الصحيح لتقسيم الورقة لكل من التقسيم الطازج والفحص المجهري الضوئي. يمكن رؤية طريقة قطع المقاطع الطازجة باستخدام ماكينة حلاقة أحادية الجانب وصفيحة شمع الأسنان في الشكل 1 ب. الأقسام الناتجة موضحة في الشكل 1C.

Discussion

في هذه المقالة ، نناقش كلا من الطرق الكمية والنوعية لقياس تشريح الأوراق والطرق التي يمكن من خلالها تحسينها. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق المنهجية على أنواع المحاصيل التمثيلية لتحديد السمات التشريحية الأكثر فائدة في التمييز بين المقاطع العرضية C3 و C4 . يعد فهم هذه السمات أمرا ضروري?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يقر المؤلفون ببرنامج الاتحاد الأوروبي لمبادرة أفق 2020 (المشروع GAIN4CROPS ، الجمعية العامة رقم 862087). يتم تمويل مركز التميز AgroCropFuture AgroECOLOGY والمحاصيل الجديدة في المناخات المستقبلية من قبل وزارة التعليم والبحث ، إستونيا. نود أن نشكر البروفيسور إيفلين لويت هارو على توفير بذور T. aestivum و Z. mays ، وبولا بالميت وفايكو فاينولا لمساعدتهم في إعداد المقاطع العرضية للأوراق ، وجواو باولو دي سيلفا سوزا للمساعدة في التحليل. تم الحصول على جميع الصور من وحدة الفحص المجهري التابعة للجامعة الإستونية لعلوم الحياة في إطار مشاريع مختلفة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger: Highly inflammable liquid and vapour.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Histo diamond knifeDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Microscope slidesNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Pipette and pipette tipsThermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, general purpose gradeFisher Scientific, GB2045836

References

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92 (2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478 (2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818 (2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618 (2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592 (2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485 (2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505 (2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14 (2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209 C4 Triticum aestivum Zea Mays

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved