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Résumé

L’évaluation des différences anatomiques entre les sections transversales des feuilles C3 et C4 permet de comprendre l’efficacité de la photosynthèse. Cet article décrit la préparation et l’examen des coupes transversales de feuilles à main levée et semi-minces, ainsi que les mises en garde concernant la préparation pour les espèces cultivées Triticum aestivum et Zea mays.

Résumé

L’efficacité accrue de la photosynthèse enC4 , par rapport au mécanisme enC3 , provient de sa capacité à concentrer le CO2 dans les cellules de gaine des faisceaux. L’efficacité de la photosynthèse en C4 et l’efficacité intrinsèque de l’utilisation de l’eau sont directement liées à la part des cellules du mésophylle et des feuilles des faisceaux, à la taille et à la densité des gaines des faisceaux, ainsi qu’à la taille, à la densité et à l’épaisseur de la paroi cellulaire des cellules des gaines des faisceaux. L’analyse microscopique rapide de ces traits peut être effectuée à main levée et sur des coupes semi-minces à l’aide de la microscopie optique conventionnelle, fournissant des informations précieuses sur l’efficacité photosynthétique dans les culturesC4 grâce à l’identification et à l’examen de types de cellules spécifiques. De plus, les erreurs dans la préparation à main levée et en coupe semi-mince qui affectent les mesures anatomiques et les diagnostics de type cellulaire sont présentées, ainsi que la façon d’éviter ces erreurs. Cette approche microscopique offre un moyen efficace de recueillir des informations sur l’acclimatation photosynthétique aux variations environnementales et aide à la sélection rapide des cultures pour les climats futurs.

Introduction

La photosynthèse est un processus fondamental où l’énergie lumineuse est convertie en énergie chimique, servant de pierre angulaire aux réseaux trophiques terrestres. La majorité des plantes suivent la voieC3 de la photosynthèse, où le principal produit photosynthétique est le glycérate 3-phosphate, un composé à trois atomes de carbone. La photosynthèse en C3 a évolué il y a plus de 2 milliards d’années dans l’atmosphère, abondante enCO2 et pauvre en O2,1. L’enzyme photosynthétique clé ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco), qui a évolué dans ces conditions, est sous-optimale pour les conditions actuelles de faible teneur en CO2 et de haute teneur en O2, car elle réagit de manière compétitive avec O2, initiant la photorespiration2. La photorespiration est une voie de gaspillage qui consomme de l’énergie au lieu de la produire et de libérer duCO2 comme sous-produit. Par conséquent, il est crucial de maintenir une concentration élevée de CO2 autour de la rubisco dans les chloroplastes pour éviter l’oxygénation 3,4. En raison de l’incapacitédes plantes C3 à concentrer le CO2, il y a une réduction importante duCO2 de l’air ambiant vers les chloroplastes, ce qui freine la photosynthèse et affecte la croissance des plantes et la production de biomasse 2,5,6.

Chez les plantesC3, la photosynthèse est limitée par l’entrée du CO2 à travers les stomates, sa diffusion à travers le mésophylle et l’activité biochimique des enzymes photosynthétiques. L’entrée du CO2 est d’abord limitée par la conductance stomatique, qui est contrôlée par les conditions environnementales telles que la température et l’humidité de l’air. Ensuite, le CO2 se diffuse à travers la phase gazeuse et liquide interne de la feuille jusqu’à la Rubisco7. Chez les plantesC3, toutes les étapes de la photosynthèse se produisent dans les chloroplastes des cellules du mésophylle, et les plantes doivent maintenir un afflux constant de CO2 de l’atmosphère dans les chloroplastes. La dépendance de la disponibilité du CO2 dans les chloroplastes sur l’ouverture des stomates, l’architecture du mésophylle et les caractéristiques individuelles des cellules et des chloroplastes rend les plantes vulnérables aux contraintes environnementales qui finissent par affecter la photosynthèse, comme la faible disponibilité de l’eau et les températures élevées 7,8,9,10, mettant particulièrement en évidence leur vulnérabilité aux conditions du changement climatique11.

Compte tenu des défis posés par les inefficacités de la voieC3, ainsi que par les limites du maintien de niveaux optimaux de CO2 et de la sensibilité aux facteurs environnementaux, chez certaines plantes, une autre voie, la voie de photosynthèseC4, a évolué. De manière caractéristique, les plantes C4 ont deux voies biochimiques séparées dans l’espace ; la fixation initiale du CO2 se produit dans les cellules du mésophylle par la phosphoénolpyruvate carboxylase, qui a une affinité plus élevée pour le CO2 que le rubisco et manque également d’activité d’oxygénation. Le produitC4 formé est ensuite transporté vers les cellules de gaine du faisceau, où il est décarboxylé, et le CO2 est à nouveau libéré et fixé par la rubisco (photosynthèse en C3)12,13,14. La plus grande affinité de la PEP carboxylase pour le CO2 et les parois cellulaires épaisses des cellules de la gaine du faisceau permet la concentration du CO2 dans les cellules de la gaine du faisceau, et ainsi, les plantes C4 minimisent la photorespiration en séparant spatialement la fixation du CO2 et le cycle de Calvin. L’adoption de la trajectoire C4 met en évidence la réponse adaptative de la nature aux contraintes environnementales, offrant un aperçu des stratégies potentielles pour améliorer la productivité et la résilience des cultures dans des conditions climatiques changeantes15.

L’anatomie spécialisée de la structure foliaire chez les plantes C4 est caractérisée par des nervures entourées de cellules de gaine vasculaire élargies contenant des chloroplastes et avec une disposition radiale des cellules du mésophylle dans un anneau externe formant un motif autour des cellules de la gaine de faisceau. Les cellules du mésophylle sont à proximité des cellules de la gaine du faisceau, ce qui permet un transport rapide et continu des métabolites entre les deux types de cellules. L’arrangement de cette cellule est typique des plantes C4 et est appelé anatomie de Kranz16. Chez les espèces C3, la spécialisation et la disposition des cellules du mésophylle peuvent varier, mais les cellules de la gaine du faisceau sont nettement plus petites et ont peu de chloroplastes ou pas de chloroplastes du tout. L’anatomie spécifique de Kranz permet de concentrer le CO2 dans les chloroplastes dans les cellules de la gaine du faisceau où se trouve l’enzyme C-3-carboxylante Rubisco, entravant efficacement la photorespiration 4,17,18. Malgré son arrangement apparemment complexe, ces changements se sont produits indépendamment à plusieurs reprises dans l’évolution des angiospermes, indiquant qu’il s’agit d’une voie évolutive relativement réalisable 19,20,21, et que divers taxons se trouvent à un stade intermédiaire entre le métabolisme du carbone C3 et C4, appelé C3-C 4 ou C2, avoir des capacités de concentration et de réassimilation du CO2 22,23,24,25.

De nombreuses plantesC4 sont des cultures d’une grande importance économique, et la modification génétique des culturesC3, comme le riz, pour améliorer leur résilience climatique et garantir le rendement a été un sujet d’intérêt au cours des dernières décennies26,27. Cependant, les efforts d’ingénierie nécessitent une compréhension détaillée de l’anatomie spécialisée duC4 et de la façon dont il contrôle la photosynthèse 2,28.

L’établissement de l’anatomie C4 Kranz est une condition préalable à la réalisation de l’objectif ambitieux d’ingénierie de la photosynthèse C4 dans les cultures C3 25. Cependant, la compréhension actuelle de la régulation de l’anatomie de Kranz et les méthodes permettant de dépister rapidement ses principaux traits anatomiques sont limitées, ce qui rend difficile l’identification des espèces hybrides. Des études antérieures ont montré que les caractéristiques clés régulant l’efficacité photosynthétique chez les plantesC3 etC4 comprennent la distance internervaire, le diamètre du complexe de gaine du faisceau et la taille des cellules de la gaine du faisceau14,29. Ces caractéristiques peuvent être facilement criblées à l’aide de coupes à main levée et analysées quantitativement à l’aide de sections semi-minces. Ici, nous décrivons la méthode d’évaluation des traits qui permettent le diagnostic de différenciation anatomiqueC3 etC4 par microscopie croisée et optique à main levée, à savoir la surface de la gaine du faisceau, la distance internervaire et la fréquence des veines.

Protocole

1. Conditions de croissance des plantes

  1. Choisissez du blé (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, « Fredis ») et du maïs (Zea mays L. Var. Saccharata, « Golden Bantam ») comme plantes représentatives C3 et C4 , respectivement. Cultivez les deux espèces de plantes dans une chambre de croissance contrôlée à partir de graines.
  2. Maintenir l’humidité relative à 55 % avec la température de l’air à 25 °C/18 °C (jour/nuit) avec une période de lumière de 12 h. Maintenir la densité de flux de photons photosynthétiques (Q) à la surface de la plante à 1200 μmol/m2/s pour représenter ses conditions de croissance naturelles. Cultivez toutes les plantes à une concentration ambiante de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Arrosez les plantes tous les 2ème jours avec de l’eau distillée et fertilisez avec la solution de Hoagland 10 jours après la levée des plantules. Cultivez les plantes dans les conditions données pendant 60 jours et utilisez des feuilles complètement déployées pour des analyses microscopiques.

2. Préparation et visualisation des sections à main levée

  1. Sélectionnez 3 feuilles matures non sénescentes de chaque plante et conservez-les dans de l’eau distillée. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir unilatérale, effectuez une coupe de nivellement pour former un angle droit avec la surface de la feuille afin de vous assurer que les sections sont des sections transversales perpendiculaires à la surface de la feuille.
  2. Placez l’échantillon de feuille sur une plaque de verre sur un morceau de cire dentaire pour stabiliser l’échantillon et éviter de glisser. Coupez en déplaçant la lame vers le bas sur l’échantillon de feuille pour couper proprement à travers les cellules. Conservez les sections transversales dans de l’eau distillée.
  3. Montez les échantillons sur une lame de verre en les plaçant sur une gouttelette d’eau et en les recouvrant d’une lamelle en verre pour la visualisation et l’imagerie microscopiques. Évitez de piéger les bulles d’air.
  4. Visualisez la lame sous un microscope optique composé à un grossissement de 10x et 20x. Enregistrez les images conformément au guide du logiciel, ainsi que l’échelle appropriée.

3. Préparation des sections semi-minces

  1. Couper des sections d’environ 3 mm x 5 mm dans les zones intercostales le long de la nervure médiane des feuilles de Z. mays et de T. aestivum sur une plaque de verre, comme à l’étape 2.2. Assurez-vous que la longueur de la section coupée longe le grain de la feuille.
  2. Placez la matière végétale dans une seringue avec 1 mL de tampon de fixation (4 % d’aldéhyde glutarique dans un tampon phosphate 0,1 M, pH = 6,9, tableau 1).
  3. Tenez la seringue verticalement, évacuez l’air et, en tenant un doigt sur l’extrémité, pompez la seringue pour créer un vide. Répétez l’opération jusqu’à ce que les échantillons se trouvent au fond de la seringue, ce qui indique une infiltration réussie.
  4. Transférez le contenu de la seringue dans un flacon en verre étiqueté et conservez-le à 4 °C pendant 48 h avant de passer à l’étape suivante (tableau 2).
  5. Pour chaque flacon, retirez délicatement le fixateur à l’aide d’une pipette et ajoutez le tampon phosphate jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape 3 fois.
  6. Retirer le tampon phosphate à l’aide d’une pipette et ajouter le tétroxyde d’osmium (ATTENTION) jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Les échantillons et autres matières organiques deviendront noirs. Utilisez des gants doubles. Laisser reposer 1 h.
  7. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’eau distillée. Laisser agir 30 min Répétez cette étape 3 fois et utilisez des gants doubles.
  8. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons avec la solution d’eau distillée 50/50 et d’éthanol. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape avec des solutions d’eau distillée et d’éthanol des séries suivantes : 30/70, 20/80, 10/90 et 2x à 100 % d’éthanol. Les échantillons dans l’une de ces solutions peuvent être laissés toute la nuit à 4 °C.
  9. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’une solution 1/3 de résine et d’éthanol. Placez les échantillons sur une plaque mélangeur et laissez reposer 2 h. Répétez cette étape avec des solutions résine-éthanol des séries suivantes : 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 et 2x à 100 % de résine. Les échantillons dans l’une de ces solutions peuvent être laissés toute la nuit à 4 °C.
  10. Couvrez les cavités d’un moule d’enrobage plat (16 cavités, dimensions de la cavité : 14 L x 4,8 L x 3 P (mm)) avec 100 % de résine et placez les échantillons à une extrémité de la cavité. Préparez des étiquettes en papier écrites au crayon pour chaque échantillon et placez-les à l’autre extrémité de la cavité.
  11. Remplissez complètement toutes les cavités avec 100% de résine et redressez les échantillons et les étiquettes s’ils ont bougé. Couvrez le moule avec un film d’enrobage et polymérisez dans un four conformément aux directives du produit en résine acrylique.
  12. Placez le bloc polymérisé avec l’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome. Coupez le bloc à l’aide d’un couteau en verre rugueux jusqu’à ce que le tissu devienne visible et que l’excès de résine soit éliminé.
  13. Découpez des sections semi-fines transversalement (1 μm) à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant. Prélevez les sections à l’aide d’une boucle d’inoculation métallique à la surface de l’eau et placez-les sur une lame de verre. Faites sécher la lame sur une plaque chauffante (60 °C) pour fixer les sections sur le verre.
  14. Colorer les parties fixées avec du bleu de toluidine (solution aqueuse à 1 %) pendant 5 s avant de rincer à l’eau distillée et de sécher à nouveau sur la plaque chauffante.
    REMARQUE : Assurez-vous que le processus de fixation chimique est effectué sous une hotte. Les couteaux en verre doivent être remplacés périodiquement pour assurer des coupes nettes qui permettent des sections sans déchirures ni distorsions.

4. Imagerie des échantillons

  1. Imagerie de coupes de feuilles fraîches
    1. Installez le microscope optique composé avec le logiciel fourni conformément au manuel.
    2. Placez la diapositive en verre sur la scène. Ajustez l’oculaire et visualisez la section à 10x pour obtenir une vue d’ensemble, puis aux objectifs 20x et 40x.
    3. À chaque objectif, naviguez dans le canal en direct, concentrez-vous sur la zone d’intérêt et localisez les cellules de la gaine du faisceau autour de la veine.
    4. Une fois le focus effectué, cliquez sur le bouton Geler et ajoutez l’échelle en appuyant sur le bouton Barre d’échelle dans l’onglet Outils. Enregistrez l’image au format . Format TIF pour l’analyse d’images.
  2. Imagerie de lames infiltrées de résine
    1. Configurez le microscope optique automatisé en liaison avec le logiciel fourni sur l’ordinateur.
    2. Chargez le canal transparent et placez la lame sur la platine du microscope. Faites la mise au point sur la section à l’aide d’un grossissement d’objectif de 40x et ajustez la luminosité pour vous assurer que toutes les structures cellulaires sont visibles.
    3. Définissez la zone d’emplacement de la section à l’aide de la fonction de navigation pour vous assurer que toute la section est imagée , puis cliquez sur le bouton Assembler.
    4. Cliquez sur Terminé , puis sur Démarrer pour permettre au microscope d’imager toute la coupe. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et ouvrez les tuiles prises au microscope.
    5. À l’aide de la fonction Aligner, assurez-vous que les tuiles ne se chevauchent pas. Après avoir généré l’image, ajustez le positionnement, la luminosité et la rotation à l’aide de l’onglet Ajuster.
    6. Imprimez l’échelle sur l’image avant de l’enregistrer dans . TIF.
  3. Mesures anatomiques à l’aide du logiciel ImageJ
    1. Ouvrez le logiciel ImageJ et chargez l’image en la faisant glisser dans la fenêtre.
    2. À l’aide de l’outil Ligne, calibrez l’échelle comme suit : tracez une ligne sur la barre d’échelle, choisissez Analyser > Définir l’échelle, remplacez la distance connue par la longueur de la barre d’échelle et remplacez l’unité de longueur par l’unité correcte.
    3. Mesurez la caractéristique potentielle en sélectionnant l’outil Ligne, en traçant une ligne à travers la zone d’intérêt et en appuyant sur la touche M .
    4. Pour les mesures de surface, sélectionnez l’outil de sélection de polygones et dessinez autour du tissu d’intérêt. Terminez en appuyant sur la touche M . Les mesures s’affichent sous la forme d’une fenêtre contextuelle, qui peut être copiée dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie des données.

Résultats

La figure 1A montre l’orientation correcte de la coupe de la feuille pour la coupe fraîche et la microscopie optique. La méthode de coupe de sections fraîches à l’aide d’un rasoir unilatéral et d’une feuille de cire dentaire est illustrée à la figure 1B. Les sections résultantes sont illustrées à la figure 1C.

La figure 2 montre des coupes à main levée de ...

Discussion

Dans cet article, nous abordons à la fois les méthodes quantitatives et qualitatives de mesure de l’anatomie des feuilles et les moyens de les optimiser. De plus, la méthodologie est appliquée à des espèces cultivées représentatives afin de déterminer quels traits anatomiques sont les plus utiles pour distinguer les sections transversales en C3 et en C4 . La compréhension de ces caractéristiques est essentielle car les espèces hybrides, appelées photosynthèseC2 , deviennen...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs saluent le programme H2020 de l’Union européenne (projet GAIN4CROPS, GA n° 862087). Le Centre d’excellence AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates est financé par le ministère de l’Éducation et de la Recherche de l’Estonie. Nous tenons à remercier le professeur Evelin Loit-Harro pour avoir fourni des graines de T. aestivum et Z . mays, Paula Palmet et Vaiko Vainola pour leur aide dans la préparation des coupes transversales de feuilles, et João Paulo de Silva Souza pour son aide dans l’analyse. Toutes les images ont été obtenues à partir de l’unité de microscopie de l’Université estonienne des sciences de la vie dans le cadre de divers projets.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger: Highly inflammable liquid and vapour.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Histo diamond knifeDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Microscope slidesNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Pipette and pipette tipsThermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, general purpose gradeFisher Scientific, GB2045836

Références

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