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요약

C3 및 C4 잎 단면 사이의 해부학적 차이를 평가하면 광합성 효율을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 논문은 Triticum aestivum 및 Zea mays 작물 종에 대한 준비 시 주의 사항과 함께 자유형 및 반얇은 잎 단면 준비 및 검사에 대해 설명합니다.

초록

C3 메커니즘에 비해 C4 광합성의 향상된 효율성은 번들 시스 셀에서 CO2 를 농축하는 능력에서 비롯됩니다. C4 광합성의 효과와 고유 물 사용 효율은 mesophyll 및 bundle leaf cell의 점유율, bundle sheaths의 크기 및 밀도, bundle sheath cell의 크기, 밀도 및 세포벽 두께와 직접적인 관련이 있습니다. 이러한 형질에 대한 신속한 현미경 분석은 기존의 광학 현미경을 사용하여 자유 및 반박형 절편에서 수행할 수 있으며, 특정 세포 유형을 식별하고 검사함으로써 C4 작물의 광합성 효율성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 또한 해부학적 측정 및 세포 유형 진단에 영향을 미치는 프리핸드 및 반박형 절편 준비의 오류와 이러한 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다. 이 현미경적 접근 방식은 환경 변화에 대한 광합성 적응에 대한 통찰력을 수집하는 효율적인 수단을 제공하고 미래 기후를 위해 작물을 신속하게 선별하는 데 도움이 됩니다.

서문

광합성은 빛 에너지가 화학 에너지로 변환되는 기본 과정으로, 육상 영양 네트워크의 초석 역할을 합니다. 대부분의 식물은 광합성의 C3 경로를 따르며, 여기서 주요 광합성 생성물은 3 탄소 화합물 인 3- 인산입니다. C3 광합성은 20 억 년 전에CO2가 풍부하고O21이 낮은 대기에서 진화했습니다. 이러한 조건에서 진화한 핵심 광합성 효소 리불로스 1,5 비스포스페이트 카르복실라아제/산소화효소(Rubisco)는O2와 경쟁적으로 반응하여 광호흡2를 시작하기 때문에 현재의 낮은CO2 높은O2 조건에는 최적이 아닙니다. 광호흡은 에너지를 생산하고CO2를 부산물로 방출하는 대신 에너지를 소비하는 낭비적인 경로입니다. 결과적으로, 산소화를 방지하기 위해 엽록체에서 Rubisco 주변의 높은 CO2 농도를 유지하는 것이 중요합니다 3,4. C3 식물이 CO2 를 농축 할 수 없기 때문에 주변 공기에서 엽록체로CO2 가 크게 감소하여 광합성을 억제하고 식물 성장 및 바이오 매스 생산에 영향을 미칩니다 2,5,6.

C3 식물에서 광합성은 기공을 통한 CO2의 진입, 중엽을 통한 확산 및 광합성 효소의 생화학 활성에 의해 제한됩니다. CO2 의 진입은 먼저 기공 전도도에 의해 제한되며, 이는 기온 및 습도와 같은 환경 조건에 의해 제어됩니다. 그런 다음 CO2 는 잎의 내부 기체 및 액체 상태를 통해 Rubisco7로 확산됩니다. C3 식물에서 광합성의 모든 단계는 중엽막 세포의 엽록체에서 발생하며 식물은 대기에서 엽록체로 CO2 의 지속적인 유입을 유지해야합니다. 엽록체의CO2 가용성이 기공 개방성, 중엽막 구조, 개별 세포 및 엽록체 특성에 의존하는 것은 식물을 낮은 물 가용성 및 고온과 같은 광합성에 궁극적으로 영향을 미치는 환경적 제약에 취약하게 만듭니다 7,8,9,10, 특히 기후 변화 조건에 대한 취약성을 강조합니다 11.

C3 경로의 비효율성으로 인한 문제와 최적의 CO2 수준 유지의 한계 및 환경 요인에 대한 민감성을 감안할 때 특정 식물에서는 또 다른 경로 인 C4 광합성 경로가 발전했습니다. 특징적으로, C4 식물은 공간적으로 분리 된 두 개의 생화학적 경로를 가지고 있습니다. 초기 CO2 고정은 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제에 의해 메소필 세포에서 발생하며, 이는 Rubisco보다 CO2에 대한 친화력이 높고 산소화 활성도 부족합니다. 형성된C4 생성물은 번들 시스 셀로 추가로 운반되어 탈카르복실화되고CO2는 다시 방출되어 Rubisco (C3 광합성)12,13,14에 의해 고정됩니다. CO2 및 다발 피복 세포의 두꺼운 세포벽에 대한 PEP 카르복실라제의 더 큰 친화력은 다발 피복 세포에서 CO2 농도를 허용하므로 C4 식물은 CO2 고정과 Calvin 회로를 공간적으로 분리하여 광 호흡을 최소화합니다. C4 경로의 채택은 환경 제약에 대한 자연의 적응 반응을 보여주며, 변화하는 기후 조건에서 작물 생산성과 회복력을 개선하기 위한 잠재적 전략에 대한 통찰력을 제공합니다15.

C4 식물의 잎 구조의 전문화 된 해부학은 엽록체를 포함하는 확대 된 혈관 다발 수초 세포로 둘러싸인 정맥과 다발 외피 세포 주위를 패턴화하는 외부 고리에 중엽 세포의 방사형 배열이 특징입니다. mesophyll cell은 bundle sheath cell에 매우 근접하여 두 세포 유형 간에 대사 산물의 빠르고 지속적인 수송을 가능하게 합니다. 이 세포의 배열은 C4 식물의 전형이며 Kranz 해부학16이라고합니다. C3 종에서 mesophyll cell의 전문화와 배치는 다양 할 수 있지만 bundle sheath cell은 뚜렷하게 작고 엽록체가 적거나 엽록체가 전혀 없습니다. 특정 Kranz 해부학은 C3- 카르복실화 효소 Rubisco가 위치한 번들 시스 세포의 엽록체에 CO2 를 농축 할 수있게하여 광 호흡을 효과적으로 방해합니다 4,17,18. 겉보기에 복잡한 배열에도 불구하고, 이러한 변화는 속씨식물의 진화에서 독립적으로 여러 번 발생했으며, 이는 상대적으로 실현 가능한 진화 경로임을 나타냅니다 19,20,21, 다양한 분류군이 C3 와 C4 개의 탄소 대사 사이의 중간 단계에 있는 것으로 나타났으며, 이는 C3-C 4 또는 C 2 라고 합니다. CO2 2 22,23,24,25를 집중하고 재동화하는 능력을 가짐.

많은 C4 식물은 경제적 중요성이 높은 작물이며, 기후 탄력성을 개선하고 수확량을 확보하기 위해 쌀과 같은 C3 작물을 유전자 조작하는 것이 지난 수십 년 동안 관심의 주제였습니다26,27. 그러나 공학적 노력에는 C4 특수 해부학과 광합성을 제어하는 방법에 대한 자세한 이해가 필요합니다 2,28.

C4 Kranz 해부학을 확립하는 것은 C4 광합성을 C3 작물25로 엔지니어링하는 야심 찬 목표를 달성하기 위한 전제 조건입니다. 그러나 Kranz 해부학적 구조의 규정과 주요 해부학적 특성을 신속하게 선별하는 방법에 대한 현재의 이해는 제한적이어서 하이브리드 종을 식별하기가 어렵습니다. 이전 연구는 C3 및 C4 식물에서 광합성 효율을 조절하는 주요 형질이 정맥 간 거리, 다발 외피 복합체의 직경 및 다발 수초 세포의 크기를 포함한다는 것을 보여주었습니다14,29. 이러한 형질은 자유 절편을 사용하여 쉽게 스크리닝할 수 있으며 반박형 절편을 사용하여 정량적으로 분석할 수 있습니다. 여기에서는 자유형 십자가 및 광학 현미경을 통해C3 및C4 해부학적 분화 진단을 가능하게 하는 특성, 즉 번들 외피 면적, 정맥 간 거리 및 정맥 빈도를 평가하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 식물 성장 조건

  1. 밀 (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis")과 옥수수 (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam")를 각각 대표적인 C3 및 C4 식물로 선택합니다. 환경 제어 성장 챔버에서 씨앗으로 두 식물 종을 모두 성장시킵니다.
  2. 55시간의 조명 기간으로 25°C/18°C(낮/밤)의 공기 온도와 함께 상대 습도를 12%로 유지합니다. 식물 표면에서 광합성 광자 플럭스 밀도(Q)를 1200μmol/m2/s로 유지하여 자연적인 성장 조건을 나타냅니다. 주변 CO2 농도 400μmol/mol에서 모든 식물을 키웁니다.
  3. 증류수로 2일 마다 식물에 물을 주고 묘목이 출현한 후 10일 후에 Hoagland의 용액으로 비료를 줍니다. 60일 동안 주어진 조건에서 식물을 키우고 현미경 분석을 위해 완전히 확장된 잎을 사용합니다.

2. 자유 단면의 준비 및 보기

  1. 각 식물에서 성숙한 노화되지 않은 잎 3 개를 선택하여 증류수에 보관하십시오. 새로운 단면 면도날을 사용하여 잎 표면과 직각을 이루도록 한 번의 수평 절단을 하여 단면이 잎 표면에 수직으로 만들어진 가로 단면이 되도록 합니다.
  2. 잎 표본을 치과용 왁스 조각의 유리판에 올려 놓아 샘플을 안정화하고 미끄러지지 않도록 합니다. 칼날을 잎 표본에 똑바로 내려 세포를 깨끗하게 절단하여 자릅니다. 단면을 증류수에 보관하십시오.
  3. 샘플을 물방울에 놓고 현미경으로 보고 이미징할 수 있도록 유리 커버슬립으로 덮어 유리 슬라이드에 장착합니다. 기포를 가두지 마십시오.
  4. 복합 광학 현미경으로 10x 및 20x 배율로 슬라이드를 볼 수 있습니다. 소프트웨어 가이드에 따라 관련 축척과 함께 이미지를 저장하십시오.

3. 반박형 절편의 준비

  1. 2.2단계와 같이 유리판에서 Z. mays 와 T. aestivum 의 잎에서 중간 갈비뼈를 따라 늑간 영역에서 약 3mm x 5mm 크기의 단면을 자릅니다. 절단된 부분의 길이가 잎의 결을 따라 이어지는지 확인하십시오.
  2. 식물 재료를 1mL의 고정 완충액(0.1M 인산염 완충액의 4% 글루타르 알데히드, pH = 6.9, 표 1)이 있는 주사기에 넣습니다.
  3. 주사기를 수직으로 잡고 공기를 제거한 다음 끝 부분에 손가락을 대고 주사기를 펌핑하여 진공을 만듭니다. 샘플이 주사기 바닥에 놓일 때까지 반복하여 성공적인 침투를 나타냅니다.
  4. 주사기의 내용물을 라벨이 부착된 유리 바이알로 옮기고 다음 단계 전에 48시간 동안 4°C에서 보관합니다(표 2).
  5. 각 바이알에 대해 피펫으로 정착제를 부드럽게 제거하고 샘플이 덮일 때까지 인산염 완충액을 추가합니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 3번 반복합니다.
  6. 피펫으로 인산염 완충액을 제거하고 샘플이 덮일 때까지 사산화오스뮴(주의)을 추가합니다. 샘플 및 기타 유기물은 검게 변합니다. 이중 장갑을 사용하십시오. 1시간 동안 그대로 두십시오.
  7. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두었다가 이 단계를 3번 반복하고 이중 장갑을 사용합니다.
  8. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 50/50 증류수-에탄올 용액으로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 100% 에탄올에서 30/70, 20/80, 10/90 및 2x 시리즈의 증류수-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다. 이러한 용액의 샘플은 4°C에서 밤새 방치할 수 있습니다.
  9. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 1/3 수지-에탄올 용액으로 덮습니다. 샘플을 믹서 플레이트에 놓고 2시간 동안 그대로 둡니다. 100% 수지에서 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 및 2x 시리즈의 수지-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다. 이러한 용액의 샘플은 4°C에서 밤새 방치할 수 있습니다.
  10. 플랫 임베딩 금형의 캐비티(캐비티 16개, 캐비티 치수: 14 L x 4.8 W x 3 D (mm))를 100% 레진으로 덮고 샘플을 캐비티의 한쪽 끝에 놓습니다. 각 샘플에 대해 연필로 쓴 종이 라벨을 준비하고 캐비티의 다른 쪽 끝에 놓습니다.
  11. 모든 캐비티를 100% 레진으로 완전히 채우고 샘플과 라벨이 움직인 경우 곧게 펴십시오. 금형을 임베딩 필름으로 덮고 아크릴 수지 제품 지침에 따라 오븐에서 중합합니다.
  12. 중합된 블록을 샘플과 함께 초박절편기의 표본 홀더에 놓습니다. 티슈가 보이고 과도한 수지가 제거될 때까지 거친 유리 칼을 사용하여 블록을 자릅니다.
  13. 유리나 다이아몬드 나이프를 사용하여 반얇은 부분을 가로(1μm) 자릅니다. 물 표면에서 금속 접종 루프를 사용하여 단면을 수집하고 유리 슬라이드에 놓습니다. 핫플레이트(60°C)에서 슬라이드를 건조시켜 섹션을 유리에 고정합니다.
  14. 고정 부분을 톨루이딘 블루(1% 수용액)로 5초 동안 염색한 후 증류수로 헹구고 핫 플레이트에서 다시 건조시킵니다.
    알림: 화학 물질 고정 과정이 흄 후드 아래에서 수행되는지 확인하십시오. 유리 칼은 찢어지거나 뒤틀림이 없는 부분을 허용하는 날카로운 절단을 보장하기 위해 주기적으로 교체해야 합니다.

4. 샘플의 이미징

  1. 신선한 잎 단면의 이미징
    1. 설명서에 따라 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 복합 광학 현미경을 설정합니다.
    2. 유리 슬라이드를 무대에 놓습니다. 접안렌즈를 조정하고 view 10x에서 단면을 얻어.view 그런 다음 20x 및 40x 대물렌즈에서.
    3. 각 목표에서 Live channel을 탐색하고, 관심 영역에 초점을 맞추고, 정맥 주변의 bundle sheath cell을 찾습니다.
    4. 초점이 맞춰지면 Freeze 버튼을 클릭하고 Tools 탭에서 Scale Bar 버튼을 눌러 스케일을 추가합니다. 에 이미지를 저장합니다. 이미지 분석을 위한 TIF 형식입니다.
  2. 수지 침투 절편의 이미징
    1. 컴퓨터에 함께 제공되는 소프트웨어와 연결하여 자동 광학 현미경을 설정합니다.
    2. 투명 채널을 로드하고 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 40x 대물렌즈 배율을 사용하여 해당 부분에 초점을 맞추고 밝기를 조정하여 모든 세포 구조가 보이도록 합니다.
    3. 네비게이터 기능을 사용하여 단면의 위치 영역을 설정하여 전체 단면이 이미지화되도록 하고 스티치 버튼을 클릭합니다.
    4. Done(완료)을 클릭한 다음 Start(시작)를 클릭하여 현미경이 전체 섹션을 이미지화할 수 있도록 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 열고 현미경으로 촬영한 타일을 엽니다.
    5. 정렬 기능을 사용하여 타일이 겹치지 않도록 합니다. 이미지를 생성한 후 조정 탭을 사용하여 위치, 밝기 및 회전을 조정합니다.
    6. 에 저장하기 전에 이미지의 배율을 인쇄하십시오. TIF 형식으로 저장할 수 있습니다.
  3. ImageJ 소프트웨어를 사용한 해부학적 측정
    1. ImageJ 소프트웨어를 열고 이미지를 창으로 끌어다 놓습니다.
    2. [선] 도구를 사용하여 다음과 같이 축척을 보정합니다. 축척 막대 위에 선을 그리고, 분석 > [축척 설정]을 선택하고, 알려진 거리를 축척 막대의 길이로 변경하고, 길이 단위를 올바른 단위로 변경합니다.
    3. Line Tool을 선택하고 관심 영역을 가로질러 선을 그린 다음 M 키를 눌러 예상 특성을 측정합니다.
    4. 면적 측정의 경우 Polygon Selection Tool 을 선택하고 관심 조직 주위를 그립니다. M 키를 눌러 마칩니다. 측정값은 팝업 창으로 표시되며, 추가 데이터 분석을 위해 스프레드시트에 복사할 수 있습니다.

결과

그림 1A 는 새로운 절편과 광학 현미경 검사를 위해 잎을 절편하기 위한 올바른 방향을 보여줍니다. 단면 면도기와 치과용 왁스 시트를 사용하여 새로운 절편을 절단하는 방법은 그림 1B에서 볼 수 있습니다. 결과 섹션은 그림 1C에 나와 있습니다.

그림 2 는 C3 식물 T. aestivum...

토론

이 기사에서는 잎 해부학적 구조를 측정하는 정량적 및 정성적 방법과 이를 최적화할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 또한, 이 방법론은 대표적인 작물 종에 적용되어 어떤 해부학적 특성이C3 및C4 단면을 구별하는 데 가장 유용한지 결정합니다. C2 광합성이라고 하는 잡종 종이 더욱 유망한 연구 분야가 되고 있기 때문에 이러한 특성을 이해하는 것이 필수적입니다. 현재...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자는 유럽 연합 H2020 프로그램(프로젝트 GAIN4CROPS, GA 번호 862087)을 인정합니다. Center of Excellence AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates는 에스토니아 교육 연구부(Ministry of Education and Research)의 재정 지원을 받습니다. T. aestivum 과 Z. mays의 씨앗을 제공해 주신 Evelin Loit-Harro 교수님, 잎 단면을 준비하는 데 도움을 주신 Paula Palmet 씨와 Vaiko Vainola 씨, 그리고 분석을 도와 주신 João Paulo de Silva Souza 씨에게 감사드립니다. 모든 이미지는 다양한 프로젝트에서 에스토니아 생명 과학 대학의 현미경 부서에서 얻었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger: Highly inflammable liquid and vapour.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Histo diamond knifeDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Microscope slidesNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Pipette and pipette tipsThermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, general purpose gradeFisher Scientific, GB2045836

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