A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
عادة ما تواجه البروتينات النباتية تحديا في تنقية البروتينات المؤتلفة من الأنظمة النباتية. يوفر هذا العمل طريقة لاستخراج وتنقية البروتين المؤتلف المفرز بشكل فعال من أبوبلاست نيكوتيانا بينثاميانا.
النباتات هي نظام تعبير حقيقي النواة تم تطويره حديثا يتم استكشافه لإنتاج بروتينات علاجية. تعد تنقية البروتينات المؤتلفة من النباتات واحدة من أهم الخطوات في عملية الإنتاج. عادة ، تم تنقية البروتينات من البروتينات الكلية القابلة للذوبان (TSP) ، ويشكل وجود بروتينات متنوعة داخل الخلايا والسيتوكرومات تحديات لخطوات تنقية البروتين اللاحقة. علاوة على ذلك ، يتم إفراز معظم البروتينات العلاجية مثل المستضدات والأجسام المضادة للحصول على الجليكوزيل المناسب ، ويؤدي وجود البروتينات المعدلة بشكل غير كامل إلى عدم اتساق هياكل المستضد أو الأجسام المضادة. يقدم هذا العمل طريقة أكثر فعالية للحصول على بروتينات مؤتلفة عالية النقاء من الفضاء اللدائن للنبات. تم تصميم البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف (GFP) ليتم إفرازه في منطقة نيكوتيانا بينثاميانا ثم يتم استخراجه باستخدام طريقة الطرد المركزي للتسلل. ثم يتم تنقية GFP-His من apoplast المستخرج بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل. على عكس الطرق التقليدية من TSP ، ينتج التنقية من apoplast بروتينات مؤتلفة عالية النقاء. وهذا يمثل تحسنا تكنولوجيا هاما لنظم الإنتاج النباتي.
في الوقت الحاضر ، هناك العديد من البروتينات العلاجية المؤتلفة المنتجة في النباتات قيد الدراسة ، بما في ذلك الأجسام المضادة واللقاحات والبروتينات النشطة بيولوجيا والإنزيمات والببتيدات الصغيرة1،2،3،4،5،6. أصبحت النباتات منصة مستخدمة بشكل متزايد لإنتاج البروتينات العلاجية نظرا لسلامتها وتكلفتها المنخفضة وقدرتها على توسيع نطاق الإنتاج بسرعة 7,8. يعد التعبير عن البروتين وتعديله في الأنظمة النباتية ، إلى جانب تنقية البرو....
1. تحضير نباتات N. benthamiana
يستهدف GFP-His للإفراز في الفضاء الأوسلجي ل N. benthamiana
تم استنساخ GFP في بلازميد pCAMBIA1300 مع ببتيد إشارة PR1a N-terminal للإفراز وعلامة His-terminal C للتنقية ، مما يولد p35s-PR1a-GFP-HIS (الشكل 1 أ). تم التعبير عن البروتين المؤتلف بشكل عابر في N. benthamiana وتم الكشف عن نطاق 30 كيلو .......
توسع استخدام النباتات لإنتاج البروتينات العلاجية بسرعة في السنوات الأخيرة1،2،3،4،5،6. يتم استنساخ الجينات المشفرة للبروتين في ناقلات التعبير وتسليمها إلى أنسجة النبات عن طريق الار.......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
ويدعم هذا العمل رابطة تشجيع الابتكار للشباب CAS (2021084) وصندوق دعم مشروع النشر الرئيسي لخطة العمل الثلاثية لمعهد علم الأحياء الدقيقة ، الأكاديمية الصينية للعلوم.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mesh nylon fine mesh yarn | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | For AWF protein extraction |
50 ml centrifuge tubes | Vazyme | TCF00150 | For centrifuge |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme | C112-02 | For clone |
FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | For clone |
FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | For clone |
ImageJ 1.5.0 | / | / | For greyscale analysis |
Large filter | Thermo Fisher | NEST | For filtering |
Laser scanning confocal microscopy | Leica SP8 | For subcellular localization | |
Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | For protein purification |
Precast protein plus gel | YEASEN | 36246ES10 | For SDS-PAGE |
Small filter | Nalgene | 1660045 | For filtering |
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit | Thermo Fisher | 34076 | For western blotting |
Triton X-100 | SCR | 30188928 | To configure the extraction buffer |
Type rotaryvang vacuum pump | Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company | 2XZ-2 | For vacuum infiltration |
Vertical mixer | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company | BE-1200 | For mixing |
β-mercaptoethanol | SIGMA | BCBK8223V | To configure the extraction buffer |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved