Méthode basée sur l’extraction Apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante

Résumé

La purification des protéines recombinantes des systèmes végétaux est généralement contestée par les protéines végétales. Ce travail fournit une méthode pour extraire et purifier efficacement une protéine recombinante sécrétée à partir de l’apoplast de Nicotiana benthamiana.

Résumé

Les plantes sont un système d’expression eucaryote en cours d’exploration pour produire des protéines thérapeutiques. La purification des protéines recombinantes des plantes est l’une des étapes les plus critiques du processus de production. En règle générale, les protéines ont été purifiées à partir de protéines solubles totales (TSP), et la présence de protéines intracellulaires et de cytochromes divers pose des défis pour les étapes ultérieures de purification des protéines. De plus, la plupart des protéines thérapeutiques comme les antigènes et les anticorps sont sécrétées pour obtenir une glycosylation correcte, et la présence de protéines incomplètement modifiées conduit à des structures d’antigènes ou d’anticorps incohérentes. Ce travail introduit une méthode plus efficace pour obtenir des protéines recombinantes hautement purifiées à partir de l’espace apoplasique des plantes. La protéine fluorescente verte recombinante (GFP) est conçue pour être sécrétée dans l’apoplast de Nicotiana benthamiana et est ensuite extraite à l’aide d’une méthode d’infiltration-centrifugation. Le GFP-His de l’apoplaste extrait est ensuite purifié par chromatographie d’affinité au nickel. Contrairement aux méthodes traditionnelles de TSP, la purification à partir de l’apoplast produit des protéines recombinantes hautement purifiées. Il s’agit d’une amélioration technologique importante pour les systèmes de production végétale.

Introduction

De nos jours, diverses protéines thérapeutiques recombinantes produites par des plantes sont à l’étude, notamment des anticorps, des vaccins, des protéines bioactives, des enzymes et de petits polypeptides 1,2,3,4,5,6. Les plantes deviennent une plate-forme de plus en plus utilisée pour produire des protéines thérapeutiques en raison de leur sécurité, de leur faible coût et de leur capacité à augmenter rapidement la production ^7,8

Protocole

1. Préparation des plantes de N. benthamiana

1. Placez les blocs de semis dans un plateau, ajoutez 1 L d’eau et laissez tremper pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’ils soient complètement saturés.
2. Saupoudrez uniformément les graines de N. benthamiana de type sauvage sur les blocs de semis, couvrez avec un couvercle et faites germer pendant 1 semaine. Cultivez N. benthamiana dans une serre avec une photopériode de 18 h, 24 °C, 45% d’humidité relative, et fertilisez toutes les 2 semaines.
3. Une fois que les graines ont germé, utilisez une pince à épiler pour retirer dél....

Discussion

L’utilisation de plantes pour produire des protéines thérapeutiques s’est rapidement développée ces dernières années 1,2,3,4,5,6. Les gènes codant pour des protéines sont clonés en vecteurs d’expression et délivrés dans les tissus végétaux par agroinfiltration. Après leur production par les cellules végé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer