Método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas

Resumen

La purificación de proteínas recombinantes de sistemas vegetales generalmente se ve desafiada por las proteínas vegetales. Este trabajo proporciona un método para extraer y purificar eficazmente una proteína recombinante secretada del apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Resumen

Las plantas son un sistema de expresión eucariota en desarrollo reciente que se está explorando para producir proteínas terapéuticas. La purificación de proteínas recombinantes de plantas es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción. Por lo general, las proteínas se purificaron a partir de proteínas solubles totales (TSP), y la presencia de proteínas intracelulares diversas y citocromos plantea desafíos para los pasos posteriores de purificación de proteínas. Además, la mayoría de las proteínas terapéuticas, como los antígenos y los anticuerpos, se secretan para obtener una glicosilación adecuada, y la presencia de proteínas modificadas incompletamente conduce a estructuras de antígenos o anticuerpos inconsistentes. Este trabajo introduce un método más eficaz para obtener proteínas recombinantes altamente purificadas a partir del espacio apoplástico de la planta. La proteína verde fluorescente recombinante (GFP) se diseña para ser secretada en el apoplasto de Nicotiana benthamiana y luego se extrae utilizando un método de infiltración-centrifugación. A continuación, el GFP-His del apoplasto extraído se purifica mediante cromatografía de afinidad de níquel. A diferencia de los métodos tradicionales de TSP, la purificación del apoplasto produce proteínas recombinantes altamente purificadas. Esto representa una importante mejora tecnológica para los sistemas de producción de las plantas.

Introducción

Hoy en día, se están estudiando varias proteínas terapéuticas recombinantes producidas por plantas, incluidos anticuerpos, vacunas, proteínas bioactivas, enzimas y pequeños polipéptidos 1,2,3,4,5,6. Las plantas se están convirtiendo en una plataforma cada vez más utilizada para la producción de proteínas terapéuticas debido a su seguridad, bajo costo y capacidad para escalar rápidamente la producción ^7,8. La expre....

Protocolo

1. Preparación de plantas de N. benthamiana

1. Coloque los bloques de plántulas en una bandeja, agregue 1 L de agua y remoje durante aproximadamente 2 h hasta que estén completamente saturados.
2. Espolvoree uniformemente las semillas de N. benthamiana de tipo silvestre en los bloques de plántulas, cúbralos con una tapa y germine durante 1 semana. Cultivar N. benthamiana en un invernadero con fotoperiodo de 18 h, 24 °C, 45% de humedad relativa y fertilizar cada 2 semanas.
3. Una vez que las semillas hayan brotado, use pinzas para quitar suavemente una plántula, teniendo....

Discusión

El uso de plantas para producir proteínas terapéuticas se ha expandido rápidamente en los últimos años 1,2,3,4,5,6. Los genes que codifican proteínas se clonan en vectores de expresión y se introducen en los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Después de la producción por parte de las células vegetale.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer