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Resumen

La purificación de proteínas recombinantes de sistemas vegetales generalmente se ve desafiada por las proteínas vegetales. Este trabajo proporciona un método para extraer y purificar eficazmente una proteína recombinante secretada del apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Resumen

Las plantas son un sistema de expresión eucariota en desarrollo reciente que se está explorando para producir proteínas terapéuticas. La purificación de proteínas recombinantes de plantas es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción. Por lo general, las proteínas se purificaron a partir de proteínas solubles totales (TSP), y la presencia de proteínas intracelulares diversas y citocromos plantea desafíos para los pasos posteriores de purificación de proteínas. Además, la mayoría de las proteínas terapéuticas, como los antígenos y los anticuerpos, se secretan para obtener una glicosilación adecuada, y la presencia de proteínas modificadas incompletamente conduce a estructuras de antígenos o anticuerpos inconsistentes. Este trabajo introduce un método más eficaz para obtener proteínas recombinantes altamente purificadas a partir del espacio apoplástico de la planta. La proteína verde fluorescente recombinante (GFP) se diseña para ser secretada en el apoplasto de Nicotiana benthamiana y luego se extrae utilizando un método de infiltración-centrifugación. A continuación, el GFP-His del apoplasto extraído se purifica mediante cromatografía de afinidad de níquel. A diferencia de los métodos tradicionales de TSP, la purificación del apoplasto produce proteínas recombinantes altamente purificadas. Esto representa una importante mejora tecnológica para los sistemas de producción de las plantas.

Introducción

Hoy en día, se están estudiando varias proteínas terapéuticas recombinantes producidas por plantas, incluidos anticuerpos, vacunas, proteínas bioactivas, enzimas y pequeños polipéptidos 1,2,3,4,5,6. Las plantas se están convirtiendo en una plataforma cada vez más utilizada para la producción de proteínas terapéuticas debido a su seguridad, bajo costo y capacidad para escalar rápidamente la producción 7,8. La expresión y modificación de proteínas en los sistemas vegetales, junto con la purificación de proteínas, son factores críticos que determinan la productividad de los biorreactores vegetales 9,10. La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son los principales retos a los que se enfrentan los sistemas de producción basados en plantas11,12.

La localización subcelular y la modificación de las proteínas recombinantes dependen del péptido señal específico codificado en el extremo N-terminal, que dirige la proteína a su destino final del orgánulo durante la expresión génica. Las proteínas recombinantes están diseñadas para localizarse en el apoplasto, el retículo endoplásmico (RE), el cloroplasto, la vacuola o el citoplasma, en función de sus propiedades únicas13. Para los antígenos y anticuerpos, se prefieren las proteínas secretadas. Antes de la secreción, las proteínas progresan a través de RE y Golgi para un correcto plegamiento y modificaciones postraduccionales 14,15,16.

Después de la producción en plantas, las proteínas recombinantes deben purificarse a partir de extractos de plantas. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales, que contienen abundantes proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos17. Para eliminar las impurezas, los extractos de plantas se someten a un fraccionamiento extenso, que incluye cromatografía de afinidad específica de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), precipitación de fitatos, precipitación de polietilenglicol y ajuste de temperatura y pH18,19. Estos pasos de eliminación de impurezas son laboriosos y pueden comprometer la calidad de la proteína.

El compartimento de la célula vegetal más allá de la membrana plasmática se define como el apoplasto, que abarca la pared celular, los espacios intercelulares y el xilema20. La fase acuosa se denomina comúnmente fluido de lavado apoplasto (AWF). AWF contiene moléculas secretadas por las células para regular numerosos avances biológicos como el transporte, el metabolismo de la pared celular y las respuestas al estrés21,22. A diferencia de TSP, los constituyentes moleculares de AWF son menos complejos. La extracción de proteínas recombinantes de AWF puede evitar la contaminación por proteínas intracelulares, productos mal plegados y restos citoplasmáticos. Brevemente, el lípido de extracción ingresa a las hojas a través de los estomas bajo presión negativa, y el AWF se recolecta por centrifugación suave23. Si bien el aislamiento de AWF se emplea ampliamente para estudiar el progreso biológico dentro del apoplasto 24,25,26,27, no se ha explotado en sistemas de producción basados en plantas.

La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son desafíos centrales para los sistemas de producción de plantas28. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales que contienen grandes cantidades de proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos29, que requieren grandes costos para su posterior purificación30. El uso de métodos de extracción de proteínas AWF para la extracción de proteínas recombinantes exógenas secretadas en apoplasto puede mejorar eficazmente la homogeneidad de las proteínas recombinantes y reducir el costo de la purificación de proteínas. Aquí, utilizamos un péptido señal PR1a para permitir la secreción de proteínas exógenas en el espacio apoplasto e introducimos un método detallado para la purificación de proteínas recombinantes a partir del AWF de N. benthamiana.

Protocolo

1. Preparación de plantas de N. benthamiana

  1. Coloque los bloques de plántulas en una bandeja, agregue 1 L de agua y remoje durante aproximadamente 2 h hasta que estén completamente saturados.
  2. Espolvoree uniformemente las semillas de N. benthamiana de tipo silvestre en los bloques de plántulas, cúbralos con una tapa y germine durante 1 semana. Cultivar N. benthamiana en un invernadero con fotoperiodo de 18 h, 24 °C, 45% de humedad relativa y fertilizar cada 2 semanas.
  3. Una vez que las semillas hayan brotado, use pinzas para quitar suavemente una plántula, teniendo cuidado de no dañar sus raíces. Cava un pequeño hoyo en el centro de una bandeja nueva, coloca la plántula en él y cubre las raíces ligeramente con tierra. Cubra con una tapa y continúe creciendo.
  4. Crezca hasta que las plántulas tengan tres hojas, con la tapa puesta. Retire la tapa cuando emerja la4ª hoja verdadera.
  5. Permita que las plantas continúen creciendo durante dos semanas más antes de la agroinfiltración.

2. Construcción de la GFP-His recombinante

  1. Realizar la optimización y síntesis de codones de N. benthamiana de GFP y PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) a partir de las secuencias de genes.
  2. Realizar la doble digestión del vector pCAMBIA1300 utilizando las enzimas Xba I y Sac I (ver Tabla de Materiales).
  3. Realice la amplificación de PR1a utilizando cebadores ascendentes (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) y cebadores posteriores (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), amplificación de GFP utilizando cebadores ascendentes (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) y cebadores descendentes (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Usando recombinación homóloga, clona PR1a y GFP en el vector de expresión de plantas pCAMBIA1300. Después de la transferencia a E. coli, seleccione clones individuales y envíelos a la empresa para su secuenciación. La comparación de los resultados de la secuenciación y el plásmido correcto es el plásmido recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, denominado p35s-PR1a-GFP-His.

3. Producción de GFP-His en N. benthamiana

  1. Agregue 1 μL de plásmido GFP en 50 μL de células receptoras Agrobacterium GV3101, mezcle suavemente y agregue a la copa de electrodos, retire después de la electrocución en el electrochoque.
  2. Esparcir Agrobacterium tumefaciens transformado en una placa de medio sólido LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina (Kan) y 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. El vector pCAMBIA1300 es resistente a kan y Agrobacterium es resistente a rif; solo el Agrobacterium correcto puede crecer en placas con Kan y Rif. Los clones monoclonales fueron los transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Use un palillo de dientes esterilizado para recoger una cantidad adecuada de AtGPG e inocularla en 4 mL de LB líquido con Kan y Rif. Cultivo a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.
  4. Subcultivar bacterias 1:50 en LB fresco (50 μg/mL de Kan, 10 mM de ácido etanosulfónico (MES) 2-(N-Morfolino), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incubar a 28 °C, 220-300 rpm durante 10-12 h.
  5. Recolectar las bacterias por centrifugación a 1500 x g durante 10 min y resuspender el pellet con 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 100 μM AS).
  6. Mida y ajuste la densidad óptica (OD) de AtGPG a OD600 = 0.8 usando MMA. Incubar las bacterias durante otras 2-4 h a temperatura ambiente. Extraiga la solución bacteriana con una jeringa sin aguja, presiónela ligeramente contra la parte posterior de las hojas y ejerza presión para que la solución penetre en las hojas. Inyecte solo las 3-4 hojas del medio por planta.
  7. Continúe cultivando N. benthamiana en el invernadero durante 3-4 días antes de cosechar las hojas para la extracción de proteínas.

4. Observación de la localización subcelular de GFP

  1. Después de 48 h de agroinfiltración, seleccione una hoja plana y utilice un perforador de 6 mm para sujetar la hoja para perforar.
  2. Gotee la solución de sacarosa al 30% en un portaobjetos de vidrio, coloque la muestra de hoja con el dorso hacia arriba y cúbrala con un cubreobjetos.
  3. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nm y detecte la fluorescencia verde a 490-550 nm después de un aumento de 400x. Haz la primera foto una vez que la diapositiva esté preparada y otra 10 min después.

5. Extracción de GFP de la planta

  1. Extracción AWF
    1. Recoja las hojas frescas intactas de N. benthamiana que expresan GFP recombinante a los 3 días después de la agroinfiltración. Trate la hoja con suavidad y mantenga la integridad de la hoja para evitar el flujo de proteínas intracelular. Use las hojas recolectadas para el siguiente paso inmediatamente para evitar la degradación de proteínas.
    2. Enjuague la hoja con ddH2O esterilizado preenfriado para eliminar los desechos.
    3. Pesar las hojas frescas y sumergir 20 g de hojas (con el lado abaxial hacia abajo) en 100 mL de tampón de fosfato de 100 mM preenfriado (PB 100 mM Na2HPO4 y 100 mM NaH2PO4 se configuraron por separado y se mezclaron en una proporción de 2,2:1 pH 7,0) en un vaso de precipitados de boca ancha de 200 mL. Cubra las hojas con hilo de malla fina de nailon de malla 100 (consulte la tabla de materiales) y un plato de plástico.
      NOTA: El preenfriamiento evita la degradación de las proteínas. Los volúmenes de tampón se pueden ajustar en función de la escala experimental. Asegúrese de que todas las hojas estén sumergidas.
    4. Coloque el vaso de precipitados en una bomba de vacío. Aplique una aspiradora de 0,8 MPa durante 1 minuto y, a continuación, restablezca rápidamente la presión atmosférica.
    5. Retire las hojas del tampón y séquelas suavemente con papel absorbente. Enrolle las hojas, envuélvalas con hilo de malla y coloque 5 g de hojas en cada tubo de centrífuga de 50 ml. Para recoger AWF, coloque las hojas enrolladas con la punta hacia arriba en tubos con hilo de malla sujeto por las tapas de los tubos.
    6. Centrifugar a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Retire las hojas y recoja el AWF en el fondo del tubo con una pipeta. Se pueden obtener aproximadamente 5 mL de AWF de cada tubo.
      NOTA: Para minimizar la interferencia de las proteínas intracelulares y extraer la máxima cantidad de proteínas AWF, la extracción se puede repetir 2x-3x, pero no más de 3x.
  2. Extracción de proteínas solubles totales
    1. Muele 20 g de hojas hasta convertirlas en polvo fino en nitrógeno líquido. Agregue tampón de extracción (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0.034% de β-mercaptoetanol (ver Tabla de Materiales)) en una proporción de 1:2.
    2. Agitar homogeneizar en una batidora vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar la centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y repita la centrifugación durante 15 min. Transfiera el sobrenadante aclarado a otro tubo.
    4. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales) para obtener extracto de proteína soluble total.

  

6. Purificación de GFP-His con cromatografía de afinidad de níquel (Ni)

NOTA: Realice todos los pasos a 4 °C.

  1. Agregue resina Ni sepharose excel (ver Tabla de materiales) a un tubo en una proporción de 1:1000 en relación con el volumen del extracto de proteína del paso 5.1.6. El volumen de resina es igual a 1/1000del volumen del extracto proteico.
  2. Lave la resina Ni 3x con un volumen de resina 10x de ddH, 2, O y PB (pH 7.0) por separado, a su vez, y elimine el sobrenadante.
  3. Incubar el extracto proteico con resina de Ni durante 2 h para permitir una unión completa. Centrifugar a 500 x g durante 5 min para eliminar las proteínas no unidas en el sobrenadante. Lavar 3 veces con un volumen de resina 20x de PB. Centrifugar a 500 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  4. Eluir GFP-His añadiendo 10 veces el volumen de resina de 250 mM de imidazol (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) y recoger el sobrenadante.

7. Tinción de proteínas con azul de Coomassie

  1. Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.
  2. Tiñir geles de proteínas con solución de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% ácido acético glacial) durante 2 h.
  3. Vierta la solución y lave con solución decolorante durante 2 h. Observa el gel; Las proteínas del gel serán de color azul.

8. Western blot de proteínas

  1. Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.
  2. Transfiere proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm a 280 mA. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% durante 1 h.
  3. Diluir los anticuerpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use la solución salina tamponada con tris y tween 20 (TBST) para lavar la membrana 4 veces durante 5 minutos.
  4. Diluir los anticuerpos anti-ratón a 1:10000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use TBST para lavar la membrana 4 veces durante 5 min.
  5. Mezcle el revelador (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Añadir 400 μL a la membrana y dejar reaccionar durante 1 min. Tome fotografías después de 1 minuto de exposición con un visualizador.

9. Ensayo de concentración de proteínas

  1. Agregue 5 μL de proteína a 1 mL de reactivo de colorante Bradford 1x y reaccione durante 5 min.
  2. Determine el valor de OD595 después de la puesta a cero y calcule la concentración de proteínas a partir de la curva estándar.

10. Cuantificación de proteínas 31

  1. Realice la transferencia occidental de muestras de proteínas junto con estándares.
  2. Realice la cuantificación de GFP por relación con los estándares utilizando el análisis en escala de grises ImageJ 1.5.0.

  

Resultados

GFP-His es el objetivo de la secreción en el espacio apoplástico de N. benthamiana
GFP se clonó en el plásmido pCAMBIA1300 con un péptido señal PR1a N-terminal para la secreción y una etiqueta His C-terminal para la purificación, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteína recombinante se expresó transitoriamente en N. benthamiana y se detectó una banda de 30 kDa mediante Western blot utilizando anticuerpo anti-His a ...

Discusión

El uso de plantas para producir proteínas terapéuticas se ha expandido rápidamente en los últimos años 1,2,3,4,5,6. Los genes que codifican proteínas se clonan en vectores de expresión y se introducen en los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Después de la producción por parte de las células vegetale...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Asociación Juvenil de Promoción de la Innovación CAS (2021084) y el Fondo de Apoyo al Proyecto de Despliegue Clave del Plan de Acción Trienal del Instituto de Microbiología de la Academia China de Ciencias.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mesh nylon fine mesh yarnGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubesVazymeTCF00150For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kitVazymeC112-02For clone
FastDigest Sac1NEBR3156SFor clone
FastDigest XbaINEBFD0685For clone
ImageJ 1.5.0//For greyscale analysis
Large filterThermo FisherNESTFor filtering
Laser scanning confocal microscopyLeica SP8For subcellular localization
Ni sepharose excelCytiva10339806For protein purification
Precast protein plus gelYEASEN36246ES10For SDS-PAGE
Small filterNalgene1660045For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076For western blotting
Triton X-100SCR30188928To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pumpZhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2For vacuum infiltration
Vertical mixerHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited companyBE-1200For mixing
β-mercaptoethanolSIGMABCBK8223VTo configure the extraction buffer

Referencias

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