식물에서 생산된 재조합 단백질의 순도를 향상시키기 위한 Apoplast-extraction 기반 방법

요약

식물 시스템에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 일반적으로 식물 단백질에 의해 도전됩니다. 이 연구는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 아포플라스트(apoplast)에서 분비된 재조합 단백질을 효과적으로 추출하고 정제하는 방법을 제공합니다.

초록

식물은 치료용 단백질을 생산하기 위해 연구되고 있는 새롭게 개발된 진핵생물 발현 시스템입니다. 식물에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 생산 공정에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 일반적으로 단백질은 총 용해성 단백질(TSP)에서 정제되었으며, 기타 세포 내 단백질 및 사이토크롬의 존재는 후속 단백질 정제 단계에서 문제를 제기합니다. 또한, 항원 및 항체와 같은 대부분의 치료용 단백질은 적절한 당화(glycosylation)를 얻기 위해 분비되며, 불완전하게 변형된 단백질의 존재는 일관성 없는 항원 또는 항체 구조로 이어집니다. 이 연구는 식물 아포가소성 공간에서 고도로 정제된 재조합 단백질을 얻는 보다 효과적인 방법을 소개합니다. 재조합 Green 형광 단백질(GFP)은 Nicotiana benthamiana 의 아포플라스트로 분비되도록 설계한 다음 침투 원심분리 방법을 사용하여 추출합니다. 추출된 아포플라스트로부터의 GFP-His는 그런 다음 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제됩니다. TSP의 기존 방법과 달리 아포플라스트에서 정제하면 고도로 정제된 재조합 단백질이 생성됩니다. 이는 플랜트 생산 시스템의 중요한 기술적 개선을 의미합니다.

서문

요즘에는 항체, 백신, 생체 활성 단백질, 효소 및 작은 폴리펩티드 1,2,3,4,5,6을 포함한 다양한 식물 생산 재조합 치료 단백질이 연구되고 있습니다. 식물은 안전성, 저렴한 비용 및 생산을 빠르게 확장할 수 있는 능력으로 인해 치료용 단백질을 생산하기 위해 점점 더 많이 활용되는 플랫폼이 되고 있습니다 ^7,8. 단백질 정제와 함께 식물 시스템의 단백질 발현 및 변형은 식물 생물반응기 ^9,10의 생산성을 결정하는 중요한 요소입니다. 식물 생산성을 높이고 고순도 표적 단백질을 얻는 것은 식물 기반 생산 시스템이 직면한 핵심 과제입니다^11,12

프로토콜

1. N. benthamiana 식물의 준비

1. 묘목 블록을 트레이에 넣고 물 1L를 넣고 완전히 포화 될 때까지 약 2 시간 동안 담가 둡니다.
2. 묘목 블록에 야생형 N. benthamiana 씨앗을 골고루 뿌리고 뚜껑을 덮고 1주일 동안 발아시킵니다. N. benthamiana 는 18시간 광주기, 24°C, 45% 상대 습도의 온실에서 키우고 2주마다 비료를 줍니다.
3. 씨앗이 싹을 틔우면 핀셋을 사용하여 뿌리에 손상을 주지 않도록 주의하면서 묘목을 부드럽게 제거합니다. 새 쟁반 중앙에 작은 구덩이를 파고 묘목을 그 안에 넣고 뿌리를 흙으로 가볍게 덮습니다. 뚜껑을 덮고 계속 자랍니다.
4. 모종에 뚜껑을 덮고 세 개의 잎이 나올 때까지 자랍니다. 4^번째 참 잎이 나오면 뚜껑을 제거하십시오.
5. 식물이 그로인침습 전에 2주 더 자라도록 하십시오.

2. 재조합형 GFP-His의 구축

1. 유전자 염기서열을 기반으로 GFP 및 PR1a(MGFVLFSQLPSFL....

토론

식물을 사용하여 치료용 단백질을 생산하는 것은 최근 몇 년 동안 빠르게 확장되었습니다 1,2,3,4,5,6. 단백질을 암호화하는 유전자는 발현 벡터로 클로닝되어 아그로인filtration을 통해 식물 조직으로 전달됩니다. 식물 세포에 의한 생산 후, 단백질은 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer