식물에서 생산된 재조합 단백질의 순도를 향상시키기 위한 Apoplast-extraction 기반 방법

요약

식물 시스템에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 일반적으로 식물 단백질에 의해 도전됩니다. 이 연구는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 아포플라스트(apoplast)에서 분비된 재조합 단백질을 효과적으로 추출하고 정제하는 방법을 제공합니다.

초록

식물은 치료용 단백질을 생산하기 위해 연구되고 있는 새롭게 개발된 진핵생물 발현 시스템입니다. 식물에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 생산 공정에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 일반적으로 단백질은 총 용해성 단백질(TSP)에서 정제되었으며, 기타 세포 내 단백질 및 사이토크롬의 존재는 후속 단백질 정제 단계에서 문제를 제기합니다. 또한, 항원 및 항체와 같은 대부분의 치료용 단백질은 적절한 당화(glycosylation)를 얻기 위해 분비되며, 불완전하게 변형된 단백질의 존재는 일관성 없는 항원 또는 항체 구조로 이어집니다. 이 연구는 식물 아포가소성 공간에서 고도로 정제된 재조합 단백질을 얻는 보다 효과적인 방법을 소개합니다. 재조합 Green 형광 단백질(GFP)은 Nicotiana benthamiana 의 아포플라스트로 분비되도록 설계한 다음 침투 원심분리 방법을 사용하여 추출합니다. 추출된 아포플라스트로부터의 GFP-His는 그런 다음 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제됩니다. TSP의 기존 방법과 달리 아포플라스트에서 정제하면 고도로 정제된 재조합 단백질이 생성됩니다. 이는 플랜트 생산 시스템의 중요한 기술적 개선을 의미합니다.

서문

요즘에는 항체, 백신, 생체 활성 단백질, 효소 및 작은 폴리펩티드 1,2,3,4,5,6을 포함한 다양한 식물 생산 재조합 치료 단백질이 연구되고 있습니다. 식물은 안전성, 저렴한 비용 및 생산을 빠르게 확장할 수 있는 능력으로 인해 치료용 단백질을 생산하기 위해 점점 더 많이 활용되는 플랫폼이 되고 있습니다 ^7,8. 단백질 정제와 함께 식물 시스템의 단백질 발현 및 변형은 식물 생물반응기 ^9,10의 생산성을 결정하는 중요한 요소입니다. 식물 생산성을 높이고 고순도 표적 단백질을 얻는 것은 식물 기반 생산 시스템이 직면한 핵심 과제입니다^11,12.

재조합 단백질의 세포 내 국소화 및 변형은 유전자 발현 중 단백질을 최종 세포 기관 목적지까지 표적으로 하는 N-말단에서 인코딩된 특정 신호 펩타이드에 따라 달라집니다. 재조합 단백질은 고유한 특성을 기반으로 아포플라스트(apoplast), 소포체(endoplasmic reticulum, ER), 엽록체(chloroplast), 액포(vacuole) 또는 세포질(cytoplasm)에 국한되도록 설계되었다¹³. 항원과 항체의 경우 분비된 단백질이 선호됩니다. 분비하기 전에 단백질은 ER과 Golgi를 통해 올바른 접힘 및 번역 후 변형을 진행합니다 14,15,16.

식물에서 생산한 후에는 식물 추출물에서 재조합 단백질을 정제해야 합니다. 전형적으로, 단백질은 풍부한 세포내 단백질, 잘못 접히거나 변형되지 않은 산물 및 시토크롬을 함유하는 총 용해성 식물 추출물로부터 정제된다¹⁷. 불순물을 제거하기 위해 식물 추출물은 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제/산소화효소(RuBisCO) 특이적 친화성 크로마토그래피, 피트테이트 침전, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 온도 및 pH^18,19 조정을 포함한 광범위한 분획을 거칩니다. 이러한 불순물 제거 단계는 번거로우며 단백질 품질을 저하시킬 수 있습니다.

원형질막 너머의 식물 세포 구획은 세포벽, 세포 간 공간 및 물관^{(xylem 20})을 포함하는 아포플라스트(apoplast)로 정의됩니다. 수성상은 일반적으로 아포플라스트 세척액(AWF)이라고 합니다. AWF에는 수송, 세포벽 대사 및 스트레스 반응과 같은 수많은 생물학적 진행을 조절하기 위해 세포에서 분비되는 분자가 포함되어 있습니다 ^21,22. TSP와 달리 AWF의 분자 구성 요소는 덜 복잡합니다. AWF에서 재조합 단백질을 추출하면 세포 내 단백질, 잘못 접힌 산물 및 세포질 잔류물에 의한 오염을 방지할 수 있습니다. 간단히 말해서, 추출 지질은 음압 하에서 기공을 통해 잎으로 들어가고, AWF는 부드러운 원심분리²³에 의해 수집된다. AWF의 분리는 apoplast^24,25,26,27 내부의 생물학적 진행 상황을 연구하기 위해 널리 사용되지만 식물 기반 생산 시스템에서는 활용되지 않았습니다.

식물 생산성을 개선하고 고순도 표적 단백질을 얻는 것은 식물 생산 시스템의 핵심 과제입니다²⁸. 전형적으로, 단백질은 다량의 세포내 단백질, 잘못 접히고 변형되지 않은 산물, 및 시토크롬^{(cytochrome)29}을 함유하는 전용해성 식물 추출물로부터 정제되며, 이는 후속 정제를 위해 많은 비용을 필요로 한다⁽³⁰). 아포플라스트로 분비되는 외인성 재조합 단백질의 추출을 위해 AWF 단백질 추출 방법을 사용하면 재조합 단백질의 균질성을 효과적으로 개선하고 단백질 정제 비용을 절감할 수 있습니다. 여기에서는 신호 펩타이드 PR1a를 사용하여 외인성 단백질이 아포플라스트 공간으로 분비될 수 있도록 하고, N. benthamiana의 AWF에서 재조합 단백질 정제를 위한 자세한 방법을 소개합니다.

프로토콜

1. N. benthamiana 식물의 준비

1. 묘목 블록을 트레이에 넣고 물 1L를 넣고 완전히 포화 될 때까지 약 2 시간 동안 담가 둡니다.
2. 묘목 블록에 야생형 N. benthamiana 씨앗을 골고루 뿌리고 뚜껑을 덮고 1주일 동안 발아시킵니다. N. benthamiana 는 18시간 광주기, 24°C, 45% 상대 습도의 온실에서 키우고 2주마다 비료를 줍니다.
3. 씨앗이 싹을 틔우면 핀셋을 사용하여 뿌리에 손상을 주지 않도록 주의하면서 묘목을 부드럽게 제거합니다. 새 쟁반 중앙에 작은 구덩이를 파고 묘목을 그 안에 넣고 뿌리를 흙으로 가볍게 덮습니다. 뚜껑을 덮고 계속 자랍니다.
4. 모종에 뚜껑을 덮고 세 개의 잎이 나올 때까지 자랍니다. 4^번째 참 잎이 나오면 뚜껑을 제거하십시오.
5. 식물이 그로인침습 전에 2주 더 자라도록 하십시오.

2. 재조합형 GFP-His의 구축

1. 유전자 염기서열을 기반으로 GFP 및 PR1a(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG)의 N. benthamiana 코돈 최적화 및 합성을 수행합니다.
2. Xba I 및 Sac I 효소를 사용하여 pCAMBIA1300 벡터의 이중 분해를 수행합니다( 재료 표 참조).
3. 업스트림 프라이머(TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT)를 사용하여 PR1a의 증폭을 수행합니다.
   TGTTCTCTTTTC) 및 다운스트림 프라이머(TCCTCG
   CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
   GTGGG), 업스트림 프라이머를 사용한 GFP 증폭(CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
   CAAGGGCGAGGA) 및 다운스트림 프라이머(GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTG
   GTGAGATCTTCCGGACTTGT)입니다.
4. 상동 재조합을 사용하여 PR1a 및 GFP를 pCAMBIA1300 식물 발현 벡터로 복제합니다. 대장균으로 이식한 후 단일 클론을 선택하여 회사로 보내 염기서열분석을 실시합니다. 염기서열분석 결과와 올바른 플라스미드를 비교하면 p35s-PR1a-GFP-His라고 하는 재조합 플라스미드 pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His가 있습니다.

3. N. benthamiana에 있는 GFP-His의 생산

1. 50 μL의 아그로박테리움 수용체 세포 GV3101에 GFP 플라스미드 1 μL를 첨가하고, 부드럽게 섞어 전극 컵에 첨가하고, 전기충격기에 감전사 후 제거합니다.
2. 50 μg/mL 카나마이신(Kan) 및 50 μg/mL 리팜피신(Rif)을 함유한 LB 고체 중간 플레이트에 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens 를 펴 바릅니다. 28 °C에서 48 시간 동안 뒤집어 배양합니다. pCAMBIA1300 벡터는 kan-resistant이고 Agrobacterium은 rif-resistant입니다. 올바른 Agrobacterium 만이 kan과 rif가있는 접시에서 자랄 수 있습니다. 단클론 클론은 A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG)로 명명된 양성 형질전환체였다.
3. 멸균된 이쑤시개를 사용하여 적당량의 AtGPG를 집어 Kan 및 Rif와 함께 4mL의 액체 LB에 접종합니다. 28 °C, 220-300 rpm에서 24 시간 동안 배양
4. 하위 배양 박테리아 1:50을 신선한 LB(50μg/mL Kan, 10mM 2-(N-Morpholino) 에탄술폰산(MES), 20μM 아세토시링곤(AS))에 넣고 28°C, 220-300rpm에서 10-12시간 동안 배양합니다.
5. 1500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 수확하고 펠릿에 1mL의 MMA(10mM MgCl₂, 10mM MES pH 5.6, 100μM AS)로 재현탁시킵니다.
6. MMA를 사용하여 AtGPG의 광학 밀도(OD)를 OD₆₀₀=0.8로 측정하고 조정합니다. 실온에서 2-4시간 더 박테리아를 배양합니다. 바늘이 없는 주사기로 세균 용액을 끌어올려 잎 뒤쪽에 가볍게 대고 압력을 가하여 용액이 잎 안으로 침투하도록 합니다. 식물 당 중간 3-4 개의 잎 만 주입하십시오.
7. 단백질 추출을 위해 잎을 수확하기 전에 온실에서 3-4일 동안 N. benthamiana 를 계속 성장시킵니다.

4. GFP의 subcellular 국소화 관찰

1. 48시간의 사포 침투 후 평평한 잎을 선택하고 6mm 구멍 펀치를 사용하여 clamp 펀칭을 위해 블레이드를 고정합니다.
2. 30% 자당 용액을 유리 슬라이드에 떨어뜨리고 뒷면이 위를 향하도록 잎 샘플을 놓고 커버 유리로 덮습니다.
3. 여기 파장을 488nm로 설정하고 400x 배율 후 490-550nm에서 녹색 형광을 감지합니다. 슬라이드가 준비되면 첫 번째 사진을 찍고 10분 후에 다른 사진을 찍습니다.

5. 식물에서 GFP 추출

1. AWF 추출
   1. 그로인침습 후 3일에 재조합 GFP를 발현하는 온전한 신선한 N. benthamiana 잎을 수집합니다. 잎을 부드럽게 다루고 잎을 온전하게 유지하여 세포 내 단백질 유출을 방지하십시오. 단백질 분해를 피하기 위해 수집된 잎을 즉시 다음 단계에 사용하십시오.
   2. 잎 잎을 사전 냉각된 멸균 ddH₂O로 헹구어 이물질을 제거합니다.
   3. 신선한 잎의 무게를 측정하고 200mL의 입이 넓은 비커에 100mL의 사전 냉각된 100mM 인산염 완충액(PB 100mM Na₂HPO₄ 및 100 mM NaH₂PO₄ 를 별도로 구성하고 2.2:1 pH 7.0의 비율로 혼합)에 20g의 잎(축면이 아래로)에 담그십시오. 100 메쉬 나일론, 가는 메쉬 실( 재료 표 참조)과 플라스틱 판으로 잎을 덮습니다.
      참고: 사전 냉각은 단백질 분해를 방지합니다. 버퍼 부피는 실험 규모에 따라 조정할 수 있습니다. 모든 잎이 잠겼는지 확인하십시오.
   4. 비커를 진공 펌프에 넣습니다. 1분 동안 0.8MPa 진공을 적용한 다음 빠르게 대기압으로 복원합니다.
   5. 완충액에서 잎을 제거하고 흡수성 종이로 부드럽게 물기를 닦아냅니다. 잎을 말아서 메쉬 실로 감싼 다음 각 50mL 원심분리기 튜브에 잎 5g을 넣습니다. AWF를 수집하려면 튜브 캡으로 고정된 메쉬 실을 사용하여 롤링된 잎을 튜브에 끝부분이 위로 향하게 놓습니다.
   6. 4 °C, 500 x g 에서 5분 동안 원심분리기 잎을 제거하고 피펫을 사용하여 튜브 바닥의 AWF를 수집합니다. 각 튜브에서 약 5mL의 AWF를 얻을 수 있습니다.
      참고: 세포 내 단백질의 간섭을 최소화하고 최대한의 AWF 단백질을 추출하기 위해 추출은 2x-3x를 반복할 수 있지만 3배 이상은 할 수 없습니다.
2. 총 용해성 단백질 추출
   1. 잎 20g을 액체 질소에 고운 가루로 갈아줍니다. 추출 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % Triton X-100, 0.034 % β- 메르 캅토 에탄올 ( 재료 표 참조))을 1 : 2 비율로 첨가하십시오.
   2. 수직 믹서에서 4 ° C에서 30 분 동안 균질하게 흔듭니다. 원심분리기는 13,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 균질화합니다.
   3. 상층액을 새 튜브로 옮기고 15분 동안 원심분리를 반복합니다. 세척된 상층액을 다른 튜브로 옮깁니다.
   4. 0.22μm 필터( 재료 표 참조)를 통해 상층액을 여과하여 총 용해성 단백질 추출물을 얻습니다.

  

6. 니켈(Ni) 친화성 크로마토그래피를 사용한 GFP-His 정제

알림: 4 °C에서 모든 단계를 수행하십시오.

1. Ni sepharose excel 수지( 재료 표 참조)를 5.1.6단계의 단백질 추출물 부피를 기준으로 1:1000 비율로 튜브에 추가합니다. 수지 부피는 단백질 추출물^{부피의 1} /1000과 같습니다.
2. Ni 수지를 ddH_{, 2}, O, PB(pH 7.0)의 10배 수지 부피로 차례로 3배 세척하고 상층액을 제거합니다.
3. 단백질 추출물을 Ni 수지와 함께 2시간 동안 배양하여 완전히 결합할 수 있도록 합니다. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 20x 용량의 PB 수지로 3회 세척합니다. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
4. 250 mM 이미 다졸 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 250 mM 이미 다졸)의 10x 수지 부피를 첨가하여 GFP-His를 용출하고 상층액을 수집합니다.

7. 단백질의 Coomassie 청색 염색

1. 단백질 샘플 40 μL에 10 μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고 10 분 동안 끓인 다음 110 V의 15 % SDS-PAGE에서 60 분 동안 실행합니다.
2. Coomassie blue 용액 (0.1 % R-250, 25 % 이소프로판올, 10 % 빙초산)을 2 시간 동안 염색 단백질 젤.
3. 용액을 붓고 탈색 용액으로 2시간 동안 세척합니다. 젤을 관찰하십시오. 겔의 단백질은 파란색으로 착색됩니다.

8. 단백질의 서부 blotting

1. 단백질 샘플 40 μL에 10 μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고 10 분 동안 끓인 다음 110 V의 15 % SDS-PAGE에서 60 분 동안 실행합니다.
2. 280mA에서 0.45μm 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다. 5% 탈지유로 1시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
3. anti-His-tag 항체를 1:5000으로 희석하고 항체가 있는 멤브레인을 1시간 동안 배양합니다. 트리스 완충 식염수와 트윈 20(TBST)을 사용하여 멤브레인을 4분 동안 5번 세척합니다.
4. 항-마우스 항체를 1:10000으로 희석하고 항체가 있는 멤브레인을 1시간 동안 배양합니다. TBST를 사용하여 멤브레인을 4분 동안 5번 세척합니다.
5. 현상액( 재료 표 참조)을 1:1의 비율로 혼합합니다. 멤브레인에 400μL를 추가하고 1분 동안 반응시킵니다. 비주얼라이저로 1분 노출 후 사진을 찍습니다.

9. 단백질 농도 분석

1. Bradford 1x 염료 시약 1mL에 단백질 5μL를 넣고 5분 동안 반응합니다.
2. 영점 조정 후 OD₅₉₅ 값을 결정하고 표준 곡선에서 단백질 농도를 계산합니다.

10. 단백질 정량 ³¹

1. 표준물질과 함께 단백질 샘플의 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행합니다.
2. ImageJ 1.5.0 그레이스케일 분석을 사용하여 표준물질에 대한 비율로 GFP를 정량화합니다.

  

결과

GFP-His는 N. benthamiana의 아포플라스틱 공간으로의 분비를 목표로 합니다
GFP는 분비를 위한 N-말단 PR1a 신호 펩타이드와 정제를 위한 C-말단 His-태그를 사용하여 pCAMBIA1300 플라스미드에 클로닝하여 p35s-PR1a-GFP-His를 생성했습니다(그림 1A). 재조합 단백질은 N. benthamiana에서 일시적으로 발현되었으며 아그로인 여과 후 3일 후에 anti-His 항체를 ...

토론

식물을 사용하여 치료용 단백질을 생산하는 것은 최근 몇 년 동안 빠르게 확장되었습니다 1,2,3,4,5,6. 단백질을 암호화하는 유전자는 발현 벡터로 클로닝되어 아그로인filtration을 통해 식물 조직으로 전달됩니다. 식물 세포에 의한 생산 후, 단백질은 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer