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Resumo

A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Resumo

As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.

Introdução

Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação de proteínas em sistemas vegetais, juntamente com a purificação de proteínas, são fatores críticos que determinam a produtividade dos biorreatores vegetais 9,10. Aumentar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são os principais desafios enfrentados pelos sistemas de produção à base de plantas11,12.

A localização subcelular e a modificação de proteínas recombinantes dependem do peptídeo sinal específico codificado no terminal N, que direciona a proteína para seu destino final de organela durante a expressão gênica. As proteínas recombinantes são projetadas para se localizar no apoplasto, retículo endoplasmático (RE), cloroplasto, vacúolo ou citoplasma, com base em suas propriedades únicas13. Para antígenos e anticorpos, as proteínas secretadas são preferidas. Antes da secreção, as proteínas progridem através de ER e Golgi para dobramento correto e modificações pós-traducionais 14,15,16.

Após a produção em plantas, as proteínas recombinantes devem ser purificadas a partir de extratos vegetais. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais, que contêm proteínas intracelulares abundantes, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos17. Para remover as impurezas, os extratos vegetais passam por um extenso fracionamento, incluindo cromatografia de afinidade específica da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase / oxigenase (RuBisCO), precipitação de fitato, precipitação de polietilenoglicol e ajuste de temperatura e pH18,19. Essas etapas de remoção de impurezas são trabalhosas e podem comprometer a qualidade da proteína.

O compartimento da célula vegetal além da membrana plasmática é definido como o apoplasto, abrangendo a parede celular, os espaços intercelulares e o xilema20. A fase aquosa é comumente chamada de fluido de lavagem apoplasto (AWF). AWF contém moléculas secretadas pelas células para regular vários progressos biológicos, como transporte, metabolismo da parede celular e respostas ao estresse21,22. Em contraste com o TSP, os constituintes moleculares do AWF são menos complexos. A extração de proteínas recombinantes da AWF pode evitar a contaminação por proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e remanescentes citoplasmáticos. Resumidamente, o lipídio de extração entra nas folhas através dos estômatos sob pressão negativa, e o AWF é coletado por centrifugação suave23. Embora o isolamento de AWF seja amplamente empregado para estudar o progresso biológico dentro do apoplast 24,25,26,27, ele não foi explorado em sistemas de produção baseados em plantas.

Melhorar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são desafios centrais para os sistemas de produção de plantas28. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais contendo grandes quantidades de proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos29, que requerem grandes custos para purificação subsequente30. O uso de métodos de extração de proteínas AWF para a extração de proteínas recombinantes exógenas secretadas em apoplasto pode efetivamente melhorar a homogeneidade das proteínas recombinantes e reduzir o custo da purificação de proteínas. Aqui, usamos um peptídeo sinal PR1a para permitir a secreção de proteínas exógenas no espaço apoplastoso e introduzimos um método detalhado para purificação de proteínas recombinantes do AWF de N. benthamiana.

Protocolo

1. Preparação de plantas de N. benthamiana

  1. Coloque os blocos de mudas em uma bandeja, adicione 1 L de água e deixe de molho por aproximadamente 2 h até saturar totalmente.
  2. Polvilhe uniformemente sementes de N. benthamiana do tipo selvagem nos blocos de mudas, cubra com uma tampa e germine por 1 semana. Cultive N. benthamiana em estufa com fotoperíodo de 18 h, 24 °C, 45% de umidade relativa e fertilize a cada 2 semanas.
  3. Depois que as sementes germinarem, use uma pinça para remover suavemente uma muda, tomando cuidado para não causar danos às raízes. Cave um pequeno buraco no centro de uma nova bandeja, coloque a muda nele e cubra as raízes levemente com terra. Cubra com uma tampa e continue a crescer.
  4. Cresça até que as mudas tenham três folhas, com a tampa. Remova a tampa quando a4ª folha verdadeira emergir.
  5. Deixe as plantas continuarem crescendo por mais duas semanas antes da infiltração agrícola.

2. Construção do GFP-His recombinante

  1. Realizar a otimização do códon de N. benthamiana e síntese de GFP e PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) com base nas sequências gênicas.
  2. Realizar a dupla digestão do vetor pCAMBIA1300 utilizando as enzimas Xba I e Sac I (ver Tabela de Materiais).
  3. Realizar amplificação de PR1a usando primers a montante (TTGGAGAGAACACGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) e primers a jusante (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), amplificação de GFP usando primers a montante (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) e primers a jusante (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Usando recombinação homóloga, clone PR1a e GFP no vetor de expressão de plantas pCAMBIA1300. Após a transferência para E. coli, selecione clones únicos e envie-os para a empresa para sequenciamento. A comparação dos resultados do sequenciamento e do plasmídeo correto é o plasmídeo recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, conhecido como p35s-PR1a-GFP-His.

3. Produção de GFP-His em N. benthamiana

  1. Adicione 1 μL de plasmídeo GFP em 50 μL de células receptoras de Agrobacterium GV3101, misture delicadamente e adicione ao copo do eletrodo, remova após a eletrocussão no eletrochoque.
  2. Espalhe Agrobacterium tumefaciens transformado em uma placa de meio sólido LB contendo 50 μg/mL de canamicina (Kan) e 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. O vetor pCAMBIA1300 é resistente a kan e Agrobacterium é resistente a rif; apenas o Agrobacterium correto pode crescer em placas com kan e rif. Os clones monoclonais foram os transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Use um palito esterilizado para coletar uma quantidade adequada de AtGPG e inoculá-lo em 4 mL de LB líquido com Kan e Rif. Cultura a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.
  4. Subcultive bactérias 1:50 em LB fresco (50 μg/mL Kan, 10 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incube a 28 °C, 220-300 rpm por 10-12 h.
  5. Colha bactérias por centrifugação a 1500 x g por 10 min e ressuspenda o pellet com 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).
  6. Meça e ajuste a densidade óptica (OD) de AtGPG para OD600 = 0,8 usando MMA. Incube as bactérias por mais 2-4 h em temperatura ambiente. Retire a solução bacteriana com uma seringa sem agulha, pressione-a levemente contra a parte de trás das folhas e pressione para penetrar a solução nas folhas. Injete apenas as 3-4 folhas do meio por planta.
  7. Continue a cultivar N. benthamiana na estufa por 3-4 dias antes de colher as folhas para extração de proteínas.

4. Observando a localização subcelular da GFP

  1. Após 48 h de agroinfiltração, selecione uma folha plana e use um furador de 6 mm para prender a lâmina para perfuração.
  2. Pingue a solução de sacarose a 30% em uma lâmina de vidro, coloque a amostra de folha com as costas voltadas para cima e cubra-a com uma lamínula.
  3. Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nm e detecte a fluorescência verde em 490-550 nm após ampliação de 400x. Tire a primeira foto assim que o slide estiver preparado e outra 10 minutos depois.

5. Extraindo GFP da planta

  1. Extração AWF
    1. Colete as folhas frescas intactas de N. benthamiana expressando GFP recombinante 3 dias após a agroinfiltração. Trate a folha com cuidado e mantenha a integridade da folha para evitar o efluxo de proteína intracelular. Use as folhas coletadas para a próxima etapa imediatamente para evitar a degradação da proteína.
    2. Enxágue a lâmina da folha com ddH2O esterilizado pré-resfriado para remover detritos.
    3. Pese as folhas frescas e mergulhe 20 g de folhas (lado abaxial para baixo) em 100 mL de tampão fosfato 100 mM pré-resfriado (PB 100 mM Na2HPO4 e 100 mM NaH2PO4 foram configurados separadamente e misturados na proporção de 2,2:1 pH 7,0) em um béquer de boca larga de 200 mL. Cubra as folhas com fio de malha fina de nylon de malha 100 (consulte a Tabela de Materiais) e uma placa de plástico.
      NOTA: O pré-resfriamento evita a degradação da proteína. Os volumes de buffer podem ser ajustados com base na escala experimental. Certifique-se de que todas as folhas estejam imersas.
    4. Coloque o copo em uma bomba de vácuo. Aplique vácuo de 0,8 MPa por 1 min e, em seguida, restaure rapidamente a pressão atmosférica.
    5. Remova as folhas do tampão e seque suavemente com papel absorvente. Enrole as folhas, embrulhe com fio de malha e coloque 5 g de folhas em cada tubo de centrífuga de 50 mL. Para coletar AWF, posicione as folhas enroladas com a ponta para cima em tubos com fio de malha preso pelas tampas dos tubos.
    6. Centrifugue a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Remova as folhas e colete o AWF no fundo do tubo usando uma pipeta. Cerca de 5 mL de AWF podem ser obtidos de cada tubo.
      NOTA: Para minimizar a interferência das proteínas intracelulares e extrair a quantidade máxima de proteínas AWF, a extração pode ser repetida 2x-3x, mas não mais do que 3x.
  2. Extração de proteína solúvel total
    1. Moer 20 g de folhas em pó fino em nitrogênio líquido. Adicione tampão de extração (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0,034% de β-mercaptoetanol (ver Tabela de Materiais)) na proporção de 1: 2.
    2. Agitar o homogeneizado num misturador vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar a centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e repetir a centrifugação durante 15 min. Transferir o sobrenadante limpo para outro tubo.
    4. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para obter o extracto de proteína solúvel total.

  

6. Purificação de GFP-His com cromatografia de afinidade de níquel (Ni)

NOTA: Execute todas as etapas a 4 °C.

  1. Adicione a resina Ni sepharose excel (consulte a Tabela de Materiais) a um tubo na proporção de 1:1000 em relação ao volume do extrato de proteína da etapa 5.1.6. O volume da resina é igual a 1/1000do volume do extrato proteico.
  2. Lave a resina de Ni 3x com 10x o volume de resina de ddH2O e PB (pH 7,0) separadamente e remova o sobrenadante.
  3. Incube o extrato de proteína com resina de Ni por 2 h para permitir a ligação total. Centrifugue a 500 x g por 5 min para remover proteínas não ligadas no sobrenadante. Lave 3x com 20x o volume de resina de PB. Centrifugue a 500 x g por 5 min e remova o sobrenadante.
  4. Eluir GFP-His adicionando 10x volume de resina de 250 mM de imidazol (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) e colete o sobrenadante.

7. Coloração de proteínas com azul de Coomassie

  1. Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.
  2. Géis de proteína de coloração com solução de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% de ácido acético glacial) por 2 h.
  3. Despeje a solução e lave com solução descolorante por 2 h. Observe o gel; As proteínas no gel serão coloridas em azul.

8. Western blotting de proteínas

  1. Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.
  2. Transfira proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm a 280 mA. Bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado por 1 h.
  3. Diluir os anticorpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use a solução salina tamponada com tris e tween 20 (TBST) para lavar a membrana 4x por 5 min.
  4. Diluir os anticorpos anti-ratinho a 1:10000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use TBST para lavar a membrana 4x por 5 min.
  5. Misture o revelador (consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:1. Adicione 400 μL à membrana e deixe reagir por 1 min. Tire fotografias após 1 min de exposição com um visualizador.

9. Ensaio de concentração de proteína

  1. Adicione 5 μL de proteína a 1 mL de reagente de corante Bradford 1x e reaja por 5 min.
  2. Determine o valor OD595 após zeragem e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão.

10. Quantificação de proteínas 31

  1. Realize Western blotting de amostras de proteínas junto com os padrões.
  2. Realize a quantificação de GFP por proporção com os padrões usando a análise em escala de cinza ImageJ 1.5.0.

  

Resultados

GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana
A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração

Discussão

O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas par...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mesh nylon fine mesh yarnGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubesVazymeTCF00150For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kitVazymeC112-02For clone
FastDigest Sac1NEBR3156SFor clone
FastDigest XbaINEBFD0685For clone
ImageJ 1.5.0//For greyscale analysis
Large filterThermo FisherNESTFor filtering
Laser scanning confocal microscopyLeica SP8For subcellular localization
Ni sepharose excelCytiva10339806For protein purification
Precast protein plus gelYEASEN36246ES10For SDS-PAGE
Small filterNalgene1660045For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076For western blotting
Triton X-100SCR30188928To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pumpZhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2For vacuum infiltration
Vertical mixerHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited companyBE-1200For mixing
β-mercaptoethanolSIGMABCBK8223VTo configure the extraction buffer

Referências

  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757 (2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995 (2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953 (2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5 (2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815 (2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249 (2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048 (2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363 (2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113 (2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755 (2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806 (2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958 (2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48 (2011).

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