Метод экстракции апопластов для повышения чистоты рекомбинантного белка растительного происхождения

Резюме

Очистка рекомбинантных белков из растительных систем обычно осложняется растительными белками. В данной работе представлен метод эффективного извлечения и очистки секретируемого рекомбинантного белка из апопласта Nicotiana benthamiana.

Аннотация

Растения являются недавно развивающейся эукариотической системой экспрессии, которая исследуется для производства терапевтических белков. Очистка растений от рекомбинантных белков является одним из наиболее важных этапов производственного процесса. Как правило, белки очищали от общего количества растворимых белков (TSP), и присутствие различных внутриклеточных белков и цитохромов создает проблемы для последующих этапов очистки белков. Более того, большинство терапевтических белков, таких как антигены и антитела, секретируются для получения надлежащего гликозилирования, а присутствие не полностью модифицированных белков приводит к несогласованным структурам антигенов или антител. В данной работе представлен более эффективный метод получения высокоочищенных рекомбинантных белков из апопластического пространства растений. Рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) секретируется в апопласт Nicotiana benthamiana , а затем экстрагируется методом инфильтрации-центрифугирования. GFP-His из экстрагированного апопласта затем очищается с помощью аффинной хроматографии никеля. В отличие от традиционных методов из TSP, при очистке от апопластов образуются высокоочищенные рекомбинантные белки. Это представляет собой важное технологическое усовершенствование для систем растениеводства.

Введение

В настоящее время изучаются различные рекомбинантные терапевтические белки растительного происхождения, включая антитела, вакцины, биоактивные белки, ферменты и малые полипептиды 1,2,3,4,5,6. Растения становятся все более используемой платформой для производства терапевтических белков благодаря их безопасности, низкой стоимости и способности быстро масштабировать производство ^7,8. Экспрессия и модификация белка в р....

протокол

1. Подготовка растений N. benthamiana

1. Поместите рассадные блоки в лоток, добавьте 1 л воды и замочите примерно на 2 часа до полного насыщения.
2. Равномерно рассыпьте по рассадным блокам семена N. benthamiana дикого типа, накройте крышкой, и проращивайте в течение 1 недели. Выращивайте N. benthamiana в теплице с 18-часовым фотопериодом, 24 °C и относительной влажностью 45% и удобряйте каждые 2 недели.
3. Как только семена прорастут, аккуратно извлеките саженец с помощью пинцета, стараясь не повредить его корни. Выкопайте в центре нового лотка небольшую ямку, поместите....

Результаты

GFP-His предназначен для секреции в апопластическое пространство N. benthamiana
GFP клонировали в плазмиду pCAMBIA1300 с N-концевым сигнальным пептидом PR1a для секреции и C-концевой His-меткой для очистки, генерируя p35s-PR1a-GFP-His (рис. 1A). Рекомбинантный белок был време?.......

Обсуждение

Использование растений для производства терапевтических белков в последние годы быстро расширилось 1,2,3,4,5,6. Гены, кодирующие белки, клонируются в векторы экспрессии и доставляю?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mesh nylon fine mesh yarn	Guangzhou Huayu Trading limited company	hy-230724-2	For AWF protein extraction
50 ml centrifuge tubes	Vazyme	TCF00150	For centrifuge
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme	C112-02	For clone
FastDigest Sac1	NEB	R3156S	For clone
FastDigest XbaI	NEB	FD0685	For clone
ImageJ 1.5.0	/	/	For greyscale analysis
Large filter	Thermo Fisher	NEST	For filtering
Laser scanning confocal microscopy	Leica SP8		For subcellular localization
Ni sepharose excel	Cytiva	10339806	For protein purification
Precast protein plus gel	YEASEN	36246ES10	For SDS-PAGE
Small filter	Nalgene	1660045	For filtering
SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit	Thermo Fisher	34076	For western blotting
Triton X-100	SCR	30188928	To configure the extraction buffer
Type rotaryvang vacuum pump	Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company	2XZ-2	For vacuum infiltration
Vertical mixer	Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company	BE-1200	For mixing
β-mercaptoethanol	SIGMA	BCBK8223V	To configure the extraction buffer