A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل واستزراع الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران (reESCs) ، مما يؤدي إلى توليد عضيات بطانة الرحم للفئران. تسهل هذه الطريقة الدراسات المختبرية لأمراض بطانة الرحم ، مما يتيح تحرير الجينات والتلاعب الخلوي الآخر.
تقدم عضيات بطانة الرحم رؤى قيمة حول تطور أمراض بطانة الرحم والفيزيولوجيا المرضية لها وتعمل كمنصات لاختبار الأدوية. بينما تم تطوير عضيات بطانة الرحم البشرية والفئران ، لا تزال الأبحاث حول عضيات بطانة الرحم في الفئران محدودة. بالنظر إلى أن الفئران يمكنها محاكاة بعض أمراض بطانة الرحم بشكل أفضل ، مثل الالتصاقات داخل الرحم ، تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء عضيات بطانة الرحم للفئران. نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل واستزراع الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران (reESCs) وتوليد عضيات بطانة الرحم في الفئران. باستخدام وسيط توسيع reESCs المكرر ، نجحنا في عزل وتوسيع reESCs بشكل مستقر ، مما يدل على إمكاناتها الثقافية على المدى الطويل. أظهرت العضيات التي تم إنشاؤها بواسطة reESC خصائص هيكلية ووظيفية نموذجية لبطانة الرحم ، بما في ذلك استجابة الهرمونات. أظهرت نتائجنا أنه يمكن استزراع عضيات بطانة الرحم في الفئران على المدى الطويل مع انتشار مستقر ، والحفاظ على البنية الغدية ، وقطبية الخلية ، والخصائص الوظيفية لظهارة بطانة الرحم. يوفر هذا النموذج العضوي الجديد المشتق من الفئران منصة قيمة لدراسة أمراض بطانة الرحم واختبار التدخلات العلاجية ، مع التطبيقات المحتملة عبر أنواع الثدييات المختلفة.
تخضع بطانة الرحم ، وهي نسيج متعدد الاستخدامات ومتجدد في جسم الإنسان ، لسفط دوري وتجديد وتمايز تحت تأثير هرمونات المبيض1. ترتبط التشوهات في بطانة الرحم بأمراض الجهاز التناسلي الأنثوية المختلفة ، مثل الانتباذ البطاني الرحمي وسرطان بطانة الرحم والعقم2. يعيق الافتقار إلى نماذج بحثية موثوقة لبطانة الرحم الدراسات المتعمقة للتسبب في هذه الأمراض والتشخيص السريري وعلاجها. في حين أن خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية تستخدم بشكل شائع لأبحاث بطانة الرحم ، فإن التحديات مثل عدم استقرار النمط الظاهري في خطوط الخلايا ، والاختلافات بين الأنواع في النماذج الحيوانية ، والقيود الأخرى تجعل من الصعب تكرار البنية الفسيولوجية المعقدة والتغيرات الوظيفية الديناميكية في بطانة الرحم البشرية3.
العضيات هي هياكل ثلاثية الأبعاد تتكون من زراعة الخلايا الجذعية في بيئة خارج الخلية ، وتمتلك قدرات التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي. يمكنهم تقليد بنية ووظيفة الأنسجة الفسيولوجية والمرضية ويتم التعرف عليهم كنماذج قبل سريرية للأمراض البشرية4. في عام 2017 ، تم تحقيق بناء ناجح لعضيات بطانة الرحم الفئرانية والبشرية من خلال تضمين أنسجة بطانة الرحم الحرة المجزأة التي تم الحصول عليها من خلال الهضم الأنزيمي في سقالة مصفوفة خارج الخلية ، متبوعة بإضافة مزيج من عوامل النمو المحددة وعوامل الإشارات للزراعة5. أظهرت النتائج أن عضيات بطانة الرحم خارج الجسم الحي تظهر قدرة تكاثرية طويلة الأمد ومستقرة ، مما يحافظ على البنية الغدية ، وقطبية الخلية ، والخصائص الوظيفية لظهارة بطانة الرحم ، بما في ذلك إفراز المخاط والاستجابة الهرمونية6. ومع ذلك ، فإن الثقافة خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية البالغة التي تشكل عضيات بطانة الرحم تتطلب دعما هيكليا يشبه الغدة ، مما يؤدي إلى تحديات مثل فقدان الجذع وصعوبات في المرور7.
حاليا ، تعتمد زراعة عضيات بطانة الرحم على طريقة ثقافة هضم كتلة الأنسجة. في دراسة سابقة ، قام فريق البحث لدينا بزراعة الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم البشرية لفترة طويلة في المختبر باستخدام وسيط مزرعة أولي يتكون بشكل أساسي من Y27632 ، والذي استخدمناه لبناء عضيات بطانة الرحم8. بناء على هذا النجاح ، قمنا بعزل وزراعة الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم من أنسجة بطانة الرحم في الفئران باستخدام وسط زراعة مركب جزيئي صغير ، مما أدى إلى إنشاء نظام زراعة مختبري طويل الأجل. علاوة على ذلك ، استخدمنا الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران (reESCs) لتوليد عضيات بطانة الرحم للفئران. سيعزز تطوير هذا النموذج الدراسات المستقبلية في المختبر وفي الجسم الحي للأمراض المرتبطة ببطانة الرحم جنبا إلى جنب مع نماذج الفئران.
تم استخدام ست فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 7/8 أسابيع تزن 200-250 جم في هذا العمل. تم إيواء الفئران في منشأة حيوانية يتم التحكم فيها بالمناخ مع إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء. تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية التي تشمل وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للتجارب على في لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى ميتشو الشعبي.
يوضح القسم التالي عملية عزل الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران وتمريرها وتجميدها وإذابتها باستخدام وسيط تمدد reESCs المكرر (REEM) الذي يتكون بشكل أساسي من Y27632 و A8301 و CHIR9902178،9. تعتمد تركيبة REEM على DMEM / F12 الخالي من المصل المخصب بتركيزات محددة من المكونات الرئيسية: 10 ميكرومتر Y27632 ، و 3 ميكرومتر CHIR99021 ، و 0.5 ميكرومتر A8301. يمكن العثور على تفاصيل شاملة حول المكونات في جدول المواد. بمجرد تخدير الفئران باستنشاق الأيزوفلوران ، يجب تنفيذ الإجراءات اللاحقة الموضحة في الشكل 1 .
1. الإجراء الجراحي
2. معالجة الأنسجة
3. ثقافة طويلة الأمد للخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران
4. إنشاء عضيات بطانة الرحم للفئران من reESCs
5. ثقافة طويلة الأمد لعضيات بطانة الرحم في الفئران
6. اختياري: نقل العضيات إلى الثقافة الملتصقة
ملاحظة: يذكر البروتوكول طريقة بديلة للحصول على reESCs مسطحة عن طريق نقل العضيات إلى الثقافة الملتصقة ، مما يسمح بإعادة هيكلة مورفولوجيا العضوية.
7. الاستزراع المتسلسل للعضيات مع الاستراديول (E2) والبروجسترون (P4)
تم إنشاء reESCs وعضيات رحم الفئران من ست إناث فئران Sprague-Dawley يتراوح وزنها بين 200 جم و 250 جراما باتباع البروتوكول الموضح في الشكل 1. بالاعتماد على نجاح الثقافة طويلة الأمد للخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم البشرية ، تتكون تركيبة REEM في الغالب من Y27632 و A8301 و CHI...
في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة مباشرة لعزل واستزراع الخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم للفئران (reESCs) وقمنا بتنقيح نظام خارج الجسم الحي الذي تم إنشاؤه مسبقا للخلايا الجذعية الظهارية لبطانة الرحم البشرية8. يستخدم نهجنا وسيطا صغيرا لثقافة الجزيئات يحتو?...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة GuangDong للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A1515110760).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-CD15 (SSEA-1) | Abcam | ab135377 | Rabbit, 1:200 (IHC) |
Anti-Estrogen Receptor alpha | Abcam | ab32063 | Rabbit, 1:200 (IHC) |
Anti-pan Cytokeratin | Abcam | ab7753 | Mouse, 1:250 (IHC) |
Anti-Progesterone Receptor | Abcam | ab101688 | Rabbit, 1:200 (IHC) |
Anti-Ki67 | Abcam | ab279653 | Mouse, 1:250 (IHC) |
A8301 | TargetMol | 909910-43-6 | |
β-Estradiol | Merck | E8875 | |
Cell Counting Kit-8 | Beyotime | C0038 | |
CD9 | BioLegend | 109819 | 1:20 (FC), Pacific Blue |
CD24 | BioLegend | 101806 | 1:20 (FC), FITC |
CD31 | BioLegend | 303120 | 1:20 (FC), APC |
CD45 | BioLegend | 301703 | 1:20 (FC), PE |
CHIR99021 | TargetMol | CT99021 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D Systems | 3700-100-01 | |
Cy3 TSA Fluorescence System Kit | APExBIO | K1051 | |
Cy5 TSA Fluorescence System Kit | APExBIO | K1052 | |
DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/mL |
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11330032 | |
EpCAM | BioLegend | 369803 | 1:20 (FC), PerCP |
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit | APExBIO | K1050 | |
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 |
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | 1:500 |
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody | APExBIO | bs-0295G-HRP | |
Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
Matrigel | Corning | 356234 | |
PrimeScript RT Master Mix | Takara | RR063A | |
Progesterone | Merck | 57-83-0 | |
Sprague-Dawley rat | Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China | ||
SSEA-1 | BioLegend | 323047 | 1:20 (FC), APC |
TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR820A | |
TriZOL | Invitrogen | 15596026CN | RNA extraction |
u-Slide 8-well plates | Ibidi | 80827 | |
Y27632 | TargetMol | 146986-50-7 | |
qPCR primers of target genes | |||
Genes | Company | Sequences | |
rat GAPDH F | Sangon biotech | GACATGCCGCCTGGAGAAAC | |
rat GAPDH R | Sangon biotech | AGCCCAGGATGCCCTTTAGT | |
rat Nanog F | Sangon biotech | GACTAGCAACGGCCTGACTCA | |
rat Nanog R | Sangon biotech | CTGCAATGGATGCTGGGATA | |
rat Sox2 F | Sangon biotech | ATTACCCGCAGCAAAATGAC | |
rat Sox2 R | Sangon biotech | ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT | |
rat Oct4 F | Sangon biotech | CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA | |
rat Oct4 R | Sangon biotech | ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved