Получение и характеристика органоидов матки крысы из эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы

Резюме

В данной работе мы представляем протокол выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs), генерирующих органоиды эндометрия крысы. Этот метод облегчает исследования заболеваний эндометрия in vitro , позволяя редактировать гены и проводить другие клеточные манипуляции.

Аннотация

Органоиды эндометрия дают ценную информацию о развитии и патофизиологии заболеваний эндометрия и служат платформой для тестирования лекарств. В то время как органоиды эндометрия человека и мыши были разработаны, исследования органоидов эндометрия крыс остаются ограниченными. Учитывая, что крысы могут лучше моделировать определенные патологии эндометрия, такие как внутриматочные спайки, это исследование было направлено на установление органоидов эндометрия крыс. Мы представляем подробный протокол выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs) и генерации органоидов эндометрия крысы. Используя усовершенствованную среду расширения reESCs, мы успешно выделили и стабильно расширили reESCs, продемонстрировав их долгосрочный культуральный потенциал. Органоиды, полученные с помощью reESC, продемонстрировали типичные структурные и функциональные характеристики эндометрия, включая гормональную реакцию. Наши результаты показали, что органоиды эндометрия крыс можно культивировать в течение длительного времени со стабильной пролиферацией, сохраняя железистую структуру, полярность клеток и функциональные характеристики эпителия эндометрия. Эта новая модель органоида эндометрия, полученная от крыс, представляет собой ценную платформу для изучения заболеваний эндометрия и тестирования терапевтических вмешательств с потенциальными применениями на различных видах млекопитающих.

Введение

Эндометрий, универсальная и регенеративная ткань в организме человека, подвергается периодическому отслаиванию, регенерации и дифференцировке под влиянием гормонов яичников¹. Аномалии эндометрия связаны с различными заболеваниями женской репродуктивной системы, такими как эндометриоз, рак эндометрия и бесплодие². Отсутствие надежных исследовательских моделей эндометрия затрудняет углубленное изучение патогенеза, клинической диагностики и лечения этих заболеваний. В то время как клеточные линии и животные модели обычно используются для исследований эндометрия, такие проблемы, как фенотипическая нестабильность в клеточных линиях, межвидовые различия в животных моделях и другие ограничения, затрудняют воспроизведение сложной физиологической структуры и динамических функциональных изменений в^{эндометрии человека}.

Органоиды представляют собой трехмерные структуры, образованные путем культивирования стволовых клеток во внеклеточной среде, обладающие способностями к самообновлению и самоорганизации. Они могут имитировать структуру и функцию физиологических и патологических тканей и признаны доклиническими моделями заболеваний человека⁴. В 2017 году было достигнуто успешное конструирование органоидов эндометрия мыши и человека путем встраивания фрагментированной свободной ткани эндометрия, полученной в результате ферментативного расщепления, во каркас внеклеточного матрикса с последующим добавлением смеси специфических факторов роста и сигнальных факторов для^{культивирования}. Результаты показали, что органоиды эндометрия ex vivo демонстрируют долгосрочную и стабильную пролиферативную способность, поддерживая железистую структуру, клеточную полярность и функциональные характеристики эпителия эндометрия, включая секрецию слизи и гормональный ответ⁶. Тем не менее, культура ex vivo взрослых стволовых клеток, образующих органоиды эндометрия, требует железистой структурной поддержки, что приводит к таким проблемам, как потеря стволовых клеток и трудности при прохождении⁷.

В настоящее время культивирование органоидов эндометрия основано на методе культивирования тканевого блок-пищеварения. В предыдущем исследовании наша исследовательская группа культивировала эпителиальные стволовые клетки эндометрия человека в течение длительного периода времени in vitro с использованием первичной питательной среды, состоящей в основном из Y27632, которую мы использовали для создания органоидов эндометрия⁸. Основываясь на этом успехе, мы выделили и культивировали эпителиальные стволовые клетки эндометрия из ткани эндометрия крысы с использованием низкомолекулярной питательной среды, создав долгосрочную систему культивирования in vitro . Кроме того, мы использовали эпителиальные стволовые клетки эндометрия крысы (reESCs) для получения органоидов эндометрия крысы. Разработка этой модели улучшит будущие исследования заболеваний эндометрия in vitro и in vivo в сочетании с моделями на крысах.

протокол

В работе использовались шесть 7/8-недельных самок крыс породы Спрэг-Доули массой 200-250 г. Крысы содержались в помещении для животных с контролируемым климатом и ограниченным доступом к пище и воде. Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с Институциональными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены институциональным наблюдательным советом по экспериментам на животных при Комитете по этике исследований Народной больницы Мэйчжоу.

В следующем разделе описан процесс выделения, пропускания, замораживания и размораживания эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы с использованием очищенной среды расширения reESCs (REEM), состоящей в основном из Y27632, A8301 и CHIR990217 ^8,9. В основе рецептуры REEM лежит бессывороточный DMEM/F12, обогащенный специфическими концентрациями ключевых компонентов: 10 мкМ Y27632, 3 мкМ CHIR99021 и 0,5 мкМ A8301. Подробную информацию о компонентах можно найти в Таблице материалов. После того, как крысы были обезболены с помощью ингаляции изофлурана, следует выполнить последующие процедуры, показанные на рисунке 1.

1. Хирургическое вмешательство

1. Обезболить крысу путем ингаляции изофлурана.
   1. Поместите крыс в индукционную камеру, наполненную 3-5% изофлураном, смешанным с кислородом. Подтвердите правильную анестезию отсутствием реакции на ущипывание пальца ноги и потерей выпрямляющего рефлекса.
   2. После обезболивания поддерживайте у крыс уровень 1-3% изофлурана с помощью носового конуса во время процедуры. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость, пока крыса находится под анестезией.
2. Сделайте низкий разрез по средней линии живота, чтобы обнажить рога матки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы перед использованием. Операционная область на крысе выбревается и дезинфицируется антисептическим раствором. Хирург носит стерильные перчатки, маску и халат. Хирургическое вмешательство проводится на стерильной простыне.
3. Выполняйте продольные разрезы с обеих сторон матки, чтобы обнажить внутренний эндометрий. Используйте лезвие скальпеля T10, чтобы соскоблить эндометрий до тех пор, пока поверхность не станет шероховатой.
4. После хирургической процедуры переведите крыс в стерильную и теплую зону восстановления с регулируемой температурой и уровнем влажности и внимательно наблюдайте за ними, пока они не придут в полное сознание и не смогут поддерживать себя в лежачем положении грудины. Размещайте группы из трех послеоперационных крыс отдельно в отдельных клетках. Чтобы облегчить послеоперационную боль, введите анальгетики, такие как бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг, подкожно); Повторяйте каждые 8-12 часов в течение 48-72 часов по мере необходимости.

2. Обработка тканей

1. Поместите все фрагменты эндометрия матки в посуду диаметром 3,5 см и промойте их 3 раза с помощью PBS.
2. Смешайте фрагменты эндометрия матки с 3 мл 1% коллагеназы I типа (разведенной в 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА) при 37 °С в течение 60 мин. Отфильтруйте непереваренную ткань с помощью клеточного фильтра 100 мкм, чтобы изолировать и собрать фильтрат для дальнейшего культивирования.
3. Собранные клетки высевать в 12-луночные планшеты в среду REEM для дальнейшего культивирования. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для засеивания клеток в каждой лунке 12-луночного планшета для достижения желаемой плотности клеток (обычно ~1-2 × 10⁵ клеток/лунку в 1,5 мл REEM).
4. Промойте клетки, собранные на шаге 2.2, в 3 раза с PBS. После первичной промывки центрифугируйте ячейки при 300 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость; ресуспендировать клеточную гранулу в PBS, содержащую 1% BSA (бычьего сывороточного альбумина), чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, и инкубировать в течение 15-30 минут на льду.
5. Инкубируйте клетки с первичными антителами, специфичными к различным маркерам (см. Таблицу материалов) в течение от 30 мин до 1 ч при 4 °C. Разведите антитела в PBS с 1% BSA в соответствии с инструкциями производителя.
6. После инкубации промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить все несвязанные антитела. После окончательной промывки ресуспендировать клетки в 600 мкл PBS с 1% BSA для анализа проточной цитометрии.
7. Сконфигурируйте прибор с помощью лазеров и фильтров, подходящих для флуорофоров, используемых в эксперименте (например, FITC, PE, APC). Используйте настройки прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для захвата активной популяции одиночных клеток, исключая мусор и агрегаты клеток. Откалибруйте проточный цитометр с помощью неокрашенного регулятора, чтобы обеспечить правильное выравнивание. Установите конкретные вентили на основе неокрашенного контроля, чтобы определить положительные популяции для каждого интересующего маркера (порог составляет 0,02%).

3. Долгосрочное культивирование эпителиальных стволовых клеток эндометрия крыс

1. Анализ колониеобразования
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ помог определить оптимальную питательную среду для reESCs.
   1. Семена P0 реЭСК помещают в 6-луночные планшеты с плотностью 1000 клеток/лунку и культивируют их в течение 14 дней либо в REEM, либо в REEM, где отсутствует A8301, Y27632 или CHIR99021.
   2. После периода культивирования клетки зафиксировать 4% параформальдегидом на 20 мин при комнатной температуре и впоследствии окрашивать их кристаллическим фиолетовым раствором еще на 20 мин.
   3. Количественно определите количество кластеров ячеек, содержащих более 50 клеток. Подбирайте питательную среду исходя из того, какая среда поддерживает рост клеточных кластеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие специфических факторов в REEM привело к снижению пролиферативной способности reESCs (рис. 1B, C). На основании этих результатов REEM был выбран в качестве предпочтительной среды для культивирования reESCs с целью оптимизации условий культивирования.
2. Меняйте REEM каждые 2 дня. Когда клетки достигнут 80-90% конфлюенции, расщепляют их 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
3. Пассаж клеток в соотношении 1:3 в REEM.
4. Пролиферационный анализ
   1. Засейте реЭСК P1, P7 и P14 в 96-луночные планшеты с плотностью 4 ×^{10 3} клеток/лунку в 150 мкл REEM.
   2. Добавьте по 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку после 24, 48, 72 и 96 ч культивирования, после чего следует 2-часовая инкубация при 37 °C.
   3. Определите скорость пролиферации, измерив абсорбцию на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.
5. Заготовка и использование замороженных бульонов
   1. Приготовьте раствор замороженного исходного материала с помощью REEM с 10% ДМСО.
   2. Соберите reESCs с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА.
   3. Ресуспендировать клеточную гранулу в замороженном исходном растворе в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл. Переложите клеточную суспензию в пробирки.
   4. Сначала заморозьте пробирки при температуре -80 °C, а затем перенесите их в жидкий азот в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы планируете размораживать клетки в ближайшее время, рекомендуется хранить замороженные клетки при температуре -80 °C в течение максимум 6 месяцев.
   5. Разогрейте REEM до 37 °C.
   6. Достаньте замороженные реЭСК и погрузите их в водяную баню при температуре 37 °C на 1-2 минуты.
   7. Размороженные reESCs переложить в 6-луночные планшеты с плотностью затравки 1 × 10⁵ клеток/лунку в REEM.
6. Иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Затравите reESCs в логарифмической фазе роста на u-Slide 8-луночные планшеты с плотностью 2 × 10^{3 клеток} на лунку и культивируйте их в REEM.
   2. Когда реЭСК достигнут 90% конфлюенции, зафиксируйте их 4% параформальдегидом в течение 20 мин. Промойте reESCs PBS 2x до и после фиксации.
   3. Пермеабилизируйте клетки 0,2% Triton X-100 в течение 10 минут.
   4. Заблокируйте клетки 30% козьей сывороткой, разведенной в 5% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в течение 30 минут при комнатной температуре. Промойте reESC PBS 2x до и после блокировки.
   5. Инкубируйте клетки с первичными антителами (анти-SSEA-1 и анти-Цитокератином) в течение 12 ч при 4 °C. Промойте reESC PBS 2x после инкубации.
   6. Инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Промойте reESC PBS 2x после инкубации.
   7. Нанесите на клетки 150 мкл DAPI, чтобы пометить все ядра.
   8. Сделайте снимки окрашенных клеток с помощью инвертированного конфокального микроскопа.

4. Получение органоидов эндометрия крысы из реЭСК

1. Генерация органоидов
   1. Когда reESCs достигают 70% конфлюенции, расщепляют клетки с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
   2. Ресуспендируйте 5 × 10⁵ reESCs в 500 μл размороженного Matrigel и поместите в 12-луночные планшеты. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 20 минут, чтобы дать возможность загустеть.
   3. Как только смесь клетка и матригель застынет, добавьте 1,5 мл / лунку REEM, чтобы покрыть матригель. Меняйте REEM каждые 2-3 дня.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Отсадите REEM и добавьте 1 мл на лунку предварительно охлажденного раствора для сбора органоидов в 12-луночные планшеты. Выдерживать на льду в течение 40-60 минут.
   2. Соберите органоиды с помощью пастеровской пипетки и центрифугируйте при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C.
   3. Промойте органоиды 2-3 раза с PBS.
   4. Зафиксируйте органоиды с помощью 4% параформальдегида на 20 минут и заблокируйте с помощью 5% BSA на 60 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мойте 2 раза с PBS до и после каждого шага.
   5. Инкубируйте органоиды в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в 1% BSA.
   6. Инкубируйте органоиды со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
   7. Защитите органоиды 200 мкл DAPI.
   8. Делайте снимки с помощью инвертированного конфокального микроскопа.
3. Окрашивание HE
   1. Обезвоживайте органоиды с помощью сортированного этанола: 70% этанола в течение 30 минут; 80% этанол в течение 30 мин; 95% этанол в течение 30 мин; 100% этанол в течение 2 х 30 мин. Очистите органоиды, погрузив их в ксилол на 2 х 30 минут.
   2. Погрузите очищенные органоиды в расплавленный парафин при температуре 60 °C на 1 час. Перенесите инфильтрованные парафином органоиды в формы для закладки, заполните формы расплавленным парафином и поместите формы в холодную пластину, чтобы парафин затвердел. После того как парафин застынет, выньте парафиновые блоки из форм и обрежьте излишки парафина.
   3. Установите парафиновые блоки на микротом. Вырежьте секции толщиной 5 μм и поместите их на теплую водяную баню (42-45 °C) для выравнивания. Аккуратно переложите срезы на стеклянные предметные стекла и просушите их на подогревателе для слайдов.
   4. Депарафинизируйте срезы, погрузив слайды в ксилол на 2 х 5 минут. Регидратируйте с помощью ряда сортированного этанола: 100% этанол в течение 2 x 3 минут; 95% этанол в течение 3 мин; 70% этанол в течение 3 мин; Промойте в дистиллированной воде.
   5. Окрашивать гематоксилином в течение 5 мин; Затем промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 минут. Дифференцировать в 1% кислотном спирте в течение нескольких секунд; промыть в проточной воде из-под крана в течение 5 минут; поместить в синий цвет в 0,2% аммиачную воду на 30 с; промыть в проточной воде из-под крана в течение 5 минут; Окрашивать эозином в течение 2 мин. Обезвоживание с помощью сортированного этанола: 70% этанола в течение 1 минуты; 95% этанол в течение 1 мин; 100% этанол в течение 2 x 1 мин. Очистить в ксилоле в течение 2 х 1 мин.
   6. Добавьте каплю монтажного средства на испачканные участки. Затем наденьте покровную салфетку на участок ткани, избегая появления пузырьков воздуха. Рассмотрите окрашенные срезы под световым микроскопом.
4. Флуоресцентное окрашивание
   1. Выполните депарафинизацию и регидратацию, как описано в шагах 4.3.1. к пункту 4.3.4.
   2. Разогрейте раствор для извлечения антигена в микроволновой печи. Поместите предметные стекла в нагретый раствор для извлечения антигена и выдержите их при температуре ниже кипения в течение 20 минут. Дайте предметным стеклам остыть в растворе для извлечения антигена в течение 40 минут. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 5 минут.
   3. Инкубируйте предметные стекла в 0,3% перекиси водорода в метаноле в течение 10 мин для подавления эндогенной активности пероксидазы. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS и инкубируйте их в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Сбивайте излишки блокирующего раствора, но не смывайте.
   4. Разведите первичное антитело в блокирующем растворе в соответствии с инструкцией производителя. Нанесите разведенное первичное антитело на срезы тканей и инкубируйте в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
   5. Вымойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS. Разведите HRP-конъюгированное вторичное антитело в блокирующем растворе в соответствии с инструкциями производителя. Разбавленное вторичное антитело нанести на участки тканей и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре во увлажненной камере. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
   6. Приготовьте рабочий раствор Флуоресцеина Тирамида в соответствии с инструкцией набора. Нанесите рабочий раствор на срезы тканей и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре во увлажненной камере. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS.
   7. Повторите шаг 4.4.1. до 4.4.5 до тех пор, пока не будет завершено окрашивание всеми тремя антителами. Нанесите каплю флуоресцентного монтажного средства с DAPI на каждый участок ткани. Осторожно наденьте покровную салфетку на участок ткани, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Осмотрите предметные стекла инвертированным конфокальным микроскопом.
5. Количественная ПЦР
   1. Соберите органоиды, как описано в шагах 4.2.1. к 4.2.3. Аспирируйте PBS и извлекайте общее количество РНК из органоидов в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Используйте любой коммерчески доступный набор для обратной транскрипции для синтеза кДНК из 1 мкг общей РНК. Настройте реакцию q-PCR в соответствии с протоколом производителя набора. В таблице материалов приведены последовательности праймеров, используемые для q-ПЦР.

5. Долгосрочное культивирование органоидов эндометрия крыс

1. Аспирируйте REEM и добавьте 1 мл раствора для сбора органоидов в течение 40 минут, чтобы диссоциировать органоиды. Инкубируйте на льду для поддержания целостности органоидов.
2. После инкубации соберите органоиды с помощью пастеровской пипетки и центрифугируйте при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C, чтобы гранулировать их для дальнейшей обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка наконечника пипетки может быть полезна при работе с более крупными органоидами (более 500 мкм) без повреждения.
3. Ресуспендировать гранулированные органоиды в Матригеле в соотношении 1:2 или 1:3 для встраивания и последующего культивирования в 12-луночные планшеты.
4. Приготовьте раствор для замороженного исходного материала: REEM с 10% ДМСО.
5. Соберите органоиды, повторно суспендируйте их в замороженном исходном растворе, а затем храните в морозильной камере при температуре -80 °C или в жидком азоте для длительного хранения.
6. Чтобы разморозить замороженные органоиды, разогрейте REEM на водяной бане при температуре 37 °C и погрузите замороженную пробирку в водяную баню, чтобы аккуратно разморозить органоиды.
7. После размораживания ресуспендируйте органоиды в 500 мкл Матригеля для повторного встраивания и культивирования в 12-луночный планшет. Выполните шаги 4.1.2. к пункту 4.1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить замороженные органоиды при температуре -80 °C в течение более короткого периода времени или переносить на жидкий азот для более длительного хранения.

6. Опционально: Перенос органоидов в адгезивную культуру

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе упоминается альтернативный метод получения плоских культур reESC путем перехода органоидов в адгезивную культуру, что позволяет реструктурировать морфологию органоидов.

1. Отсадите REEM и добавьте 1 мл раствора для сбора органоидов для диссоциации органоидов. Инкубируйте на льду для поддержания целостности органоидов.
2. После инкубации соберите органоиды с помощью пипетки Пастера и центрифуги и гранулируйте их в дозе 300 × г в течение 3 минут при температуре 4 °C.
3. Ресуспендируйте органоиды в 3 мл предварительно подогретого REEM и переложите ресуспендированные органоиды в чашку диаметром 3,5 см. Меняйте носитель REEM каждые 2 дня.
4. Когда клетки достигнут 70% конфлюенции, расщепляют их с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
5. Восстановите органоиды с помощью reESCs, выполнив шаги с 4.1.1 по 4.1.3.

7. Последовательное культивирование органоидов эстрадиолом (Е₂) и прогестероном (Р₄)

1. Приготовьте исходные растворы Е₂ и Р₄ в ДМСО. Разбавлять исходные растворы до требуемых рабочих концентраций (Е₂: 10 нМ; P₄: 1 мкМ) в РЗЭМ, следя за тем, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1% во избежание цитотоксических эффектов.
2. Культивируйте органоиды в REEM как шаги 4.1.1. к пункту 4.1.3. на 4 дня. Замените среду на REEM с добавлением Е₂ и культуру на 7 дней. Ежедневно контролируйте рост и морфологию органоидов. Меняйте средство каждые 2-3 дня.
3. Замените среду на REEM с добавлением Е₂ и Р₄. Ежедневно контролируйте рост и морфологию органоидов. Меняйте средство каждые 2-3 дня. Продолжайте культивировать органоиды в течение 7 дней.

Результаты

РеЭСК и органоиды матки крыс были получены от шести самок крыс Спрэг-Доули с массой от 200 г до 250 г в соответствии с протоколом, описанным на рисунке 1. Основываясь на успехе долгосрочного культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия челов?...

Обсуждение

В этом исследовании мы описали простой метод выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs) и усовершенствовали ранее созданную систему ex vivo для эпителиальных стволовых клеток эндометрия человека⁸. В нашем подход...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG