Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais (reESCs) de ratos, gerando organoides endometriais de ratos. Este método facilita estudos in vitro de doenças endometriais, permitindo a edição de genes e outras manipulações celulares.

Resumo

Os organoides endometriais oferecem informações valiosas sobre o desenvolvimento e a fisiopatologia das doenças endometriais e servem como plataformas para testes de drogas. Embora organoides endometriais humanos e de camundongos tenham sido desenvolvidos, a pesquisa sobre organoides endometriais de ratos permanece limitada. Dado que os ratos podem simular melhor certas patologias endometriais, como aderências intrauterinas, este estudo teve como objetivo estabelecer organoides endometriais de ratos. Apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e cultura de células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) e a geração de organoides endometriais de ratos. Usando um meio de expansão refinado de reESCs, isolamos com sucesso e expandimos de forma estável as reESCs, demonstrando seu potencial de cultura a longo prazo. Os organoides gerados por reESC exibiram características estruturais e funcionais típicas do endométrio, incluindo responsividade hormonal. Nossos resultados mostraram que os organoides endometriais de ratos podem ser cultivados a longo prazo com proliferação estável, mantendo a estrutura glandular, a polaridade celular e as características funcionais do epitélio endometrial. Este novo modelo de organoide endometrial derivado de rato fornece uma plataforma valiosa para estudar doenças endometriais e testar intervenções terapêuticas, com aplicações potenciais em várias espécies de mamíferos.

Introdução

O endométrio, um tecido versátil e regenerativo do corpo humano, sofre descamação, regeneração e diferenciação periódicas sob a influência de hormônios ovarianos¹. Anormalidades no endométrio estão ligadas a várias doenças do sistema reprodutor feminino, como endometriose, câncer de endométrio e infertilidade². A falta de modelos de pesquisa confiáveis para o endométrio dificulta estudos aprofundados da patogênese, diagnóstico clínico e tratamento dessas doenças. Embora as linhagens celulares e os modelos animais sejam comumente utilizados para a pesquisa endometrial, desafios como instabilidade fenotípica nas linhagens celulares, diferenças entre espécies em modelos animais e outras limitações dificultam a replicação da complexa estrutura fisiológica e das mudanças funcionais dinâmicas no endométrio humano³.

Organoides são estruturas tridimensionais formadas pela cultura de células-tronco em um ambiente extracelular, possuindo capacidades de auto-renovação e auto-organização. Eles podem mimetizar a estrutura e função de tecidos fisiológicos e patológicos e são reconhecidos como modelos pré-clínicos de doenças humanas⁴. Em 2017, a construção bem-sucedida de organoides endometriais de camundongos e humanos foi alcançada incorporando tecido endometrial livre fragmentado obtido por digestão enzimática em um andaime de matriz extracelular, seguido pela adição de uma mistura de fatores de crescimento específicos e fatores de sinalização para cultivo⁵. Os resultados demonstraram que os organoides endometriais ex vivo exibem capacidade proliferativa estável e de longo prazo, mantendo a estrutura glandular, a polaridade celular e as características funcionais do epitélio endometrial, incluindo secreção de muco e resposta hormonal⁶. No entanto, a cultura ex vivo de células-tronco adultas formando os organoides endometriais requer suporte estrutural semelhante a glândula, levando a desafios como perda de estaminalidade e dificuldades na passagem⁷.

Atualmente, o cultivo de organoides endometriais depende do método de cultura de digestão em bloco de tecido. Em um estudo anterior, nossa equipe de pesquisa cultivou células-tronco epiteliais endometriais humanas por um longo período in vitro usando um meio de cultura primário composto principalmente de Y27632, que empregamos para construir organoides endometriais⁸. Com base nesse sucesso, isolamos e cultivamos células-tronco epiteliais endometriais de tecido endometrial de rato usando um meio de cultura composto de molécula pequena, estabelecendo um sistema de cultura in vitro de longo prazo. Além disso, utilizamos células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) para gerar organoides endometriais de ratos. O desenvolvimento deste modelo irá melhorar futuros estudos in vitro e in vivo de doenças relacionadas ao endométrio em conjunto com modelos de ratos.

Protocolo

Seis ratas Sprague-Dawley de 7/8 semanas de idade, pesando 200-250 g, foram utilizadas neste trabalho. Os ratos foram alojados em uma instalação de animais climatizada com acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes Institucionais para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de revisão institucional para experimentos com animais no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Popular de Meizhou.

A seção a seguir descreve o processo de isolamento, passagem, congelamento e descongelamento de células-tronco epiteliais endometriais de ratos usando um meio de expansão reESCs refinado (REEM) composto principalmente de Y27632, A8301 e CHIR990217 ^8,9. A formulação REEM é baseada em DMEM/F12 sem soro enriquecido com concentrações específicas de componentes-chave: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 e 0,5 μM A8301. Detalhes abrangentes sobre os componentes podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Uma vez que os ratos tenham sido anestesiados com inalação de isoflurano, os procedimentos subsequentes descritos na Figura 1 devem ser implementados.

1. Procedimento cirúrgico

1. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano.
   1. Coloque os ratos em uma câmara de indução cheia de isoflurano a 3-5% misturado com oxigênio. Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta a uma pitada do dedo do pé e pela perda do reflexo de endireitamento.
   2. Uma vez anestesiados, mantenha os ratos sob isoflurano a 1-3% por meio de um cone nasal durante o procedimento. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto o rato estiver sob anestesia.
2. Faça uma incisão na linha média abdominal baixa para expor os chifres do útero.
   NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados antes do uso. A área cirúrgica do rato é raspada e desinfetada com uma solução anti-séptica. O cirurgião usa luvas estéreis, máscara e bata. O procedimento cirúrgico é realizado em uma cortina estéril.
3. Faça incisões longitudinais em ambos os lados do útero para expor o endométrio interno. Use uma lâmina de bisturi T10 para raspar o endométrio até que a superfície fique áspera.
4. Após o procedimento cirúrgico, transfira os ratos para uma área de recuperação estéril e quente com níveis regulados de temperatura e umidade e monitore-os de perto até que recuperem a consciência total e possam se sustentar em uma posição esternal reclinada. Grupos de três ratos pós-operatórios separadamente em gaiolas separadas. Para aliviar a dor pós-cirúrgica, administre analgésicos como buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, por via subcutânea); Repita a cada 8-12 h por até 48-72 h, conforme necessário.

2. Processamento de tecidos

1. Coloque todos os fragmentos de endométrio uterino em um prato de 3,5 cm e lave-os 3x com PBS.
2. Misture os fragmentos de endométrio uterino com 3 mL de colagenase tipo I a 1% (diluída em 0,25% de tripsina / 1 mM de EDTA) a 37 ° C por 60 min. Filtrar o tecido não digerido com um filtro de células de 100 μm para isolar e recolher o filtrado para posterior cultura.
3. Semeie as células coletadas em placas de 12 poços em meio REEM para posterior cultivo. Calcule o volume da suspensão celular necessária para semear as células em cada poço da placa de 12 poços para atingir a densidade celular desejada (normalmente ~ 1-2 × 10⁵ células / poço em 1,5 mL de REEM).
4. Lave as células coletadas na etapa 2.2 por 3x com PBS. Após a lavagem inicial, centrifugue as células a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante; ressuspenda o pellet celular em PBS contendo 1% de BSA (albumina de soro bovino) para minimizar a ligação inespecífica e incube por 15-30 min no gelo.
5. Incubar as células com anticorpos primários específicos para diferentes marcadores (ver Tabela de Materiais) durante 30 min a 1 h a 4 °C. Dilua os anticorpos em PBS com 1% de BSA de acordo com as instruções do fabricante.
6. Após a incubação, lave as células 2x com PBS para remover quaisquer anticorpos não ligados. Após a lavagem final, ressuspenda as células em 600 μL de PBS com 1% de BSA para análise de citometria de fluxo.
7. Configure o instrumento com lasers e filtros apropriados para os fluoróforos usados no experimento (por exemplo, FITC, PE, APC). Use as configurações de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para bloquear a população de célula única ativa, excluindo detritos e agregados de células. Calibre o citômetro de fluxo usando um controle não corado para garantir o alinhamento adequado. Defina portões específicos com base no controle não corado para definir populações positivas para cada marcador de interesse (o limite é de 0,02%).

3. Cultura a longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais de rato

1. Ensaio de formação de colônias
   NOTA: Este ensaio ajudou a determinar o meio de cultura ideal para reESCs.
   1. Semeie reESCs P0 em placas de 6 poços a uma densidade de 1.000 células/poço e cultive-as por 14 dias em REEM ou REEM sem A8301, Y27632 ou CHIR99021.
   2. Após o período de cultivo, fixar as células com paraformaldeído a 4% por 20 min em temperatura ambiente e, posteriormente, corá-las com solução de cristal violeta por mais 20 min.
   3. Quantifique o número de aglomerados de células contendo mais de 50 células. Selecione o meio de cultura com base em qual meio suporta o crescimento de aglomerados de células.
      NOTA: A omissão de fatores específicos do REEM resultou em uma diminuição da capacidade proliferativa das reESCs (Figura 1B,C). Com base nesses achados, o REEM foi selecionado como o meio preferido para a cultura de reESCs para otimizar as condições de cultivo.
2. Troque o REEM a cada 2 dias. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, digeri-las com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
3. Passe as células na proporção de 1:3 em REEM.
4. Ensaio de proliferação
   1. Semeie as reESCs P1, P7 e P14 em placas de 96 poços a uma densidade de 4 × 10³ células/poço em 150 μL de REEM.
   2. Adicionar 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço após 24, 48, 72 e 96 h de cultura, seguido de uma incubação de 2 h a 37 °C.
   3. Determinar a taxa de proliferação medindo a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
5. Preparação e utilização de matérias-primas congeladas
   1. Prepare a solução de estoque congelada usando REEM com DMSO a 10%.
   2. Colha as reESCs com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA.
   3. Ressuspenda o grânulo celular em solução de estoque congelada a uma concentração de 1 × 10⁶ células / mL. Transfira a suspensão celular para tubos.
   4. Congelar os tubos primeiro a -80 °C e, em seguida, transferi-los para nitrogênio líquido em 24 h.
      NOTA: Se pretende descongelar as células em breve, recomenda-se armazenar as células congeladas a -80 °C por um período máximo de 6 meses.
   5. Pré-aqueça o REEM a 37 °C.
   6. Recupere as reESCs congeladas e mergulhe-as em banho-maria a 37 °C por 1-2 min.
   7. Transferir as reESCs descongeladas para placas de 6 poços com uma densidade de semeadura de 1 × 10⁵ células/poço em REEM.
6. Coloração de imunofluorescência
   1. Semeie reESCs na fase de crescimento logarítmico em placas de 8 poços u-Slide a uma densidade de 2 × 10³ células por poço e cultive-as em REEM.
   2. Quando as reESCs atingirem 90% de confluência, fixe-as com paraformaldeído a 4% por 20 min. Lave as reESCs com PBS 2x antes e depois da fixação.
   3. Permeabilize as células com 0,2% de Triton X-100 por 10 min.
   4. Bloqueie as células com 30% de soro de cabra diluído em 5% de albumina de soro bovino (BSA) por 30 min em temperatura ambiente. Lave as reESCs com PBS 2x antes e depois do bloqueio.
   5. Incubar as células com anticorpos primários (anti-SSEA-1 e anti-citoqueratina) durante 12 h a 4 °C. Lave as reESCs com PBS 2x após a incubação.
   6. Incube as células com anticorpos secundários por 1 h em temperatura ambiente. Lave as reESCs com PBS 2x após a incubação.
   7. Contra-core as células com 150 μL de DAPI para marcar todos os núcleos.
   8. Capture imagens das células coradas usando um microscópio confocal invertido.

4. Estabelecimento de organoides endometriais de ratos a partir de reESCs

1. Geração dos organoides
   1. Quando as reESCs atingirem 70% de confluência, digerir as células com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
   2. Ressuspenda 5 × 10⁵ reESCs em 500 μL de Matrigel descongelado e coloque em placas de 12 poços. Incubar as placas a 37 °C durante 20 min para permitir a gelificação.
   3. Assim que a mistura célula-Matrigel solidificar, adicione 1,5 mL/poço REEM para cobrir o Matrigel. Troque o REEM a cada 2-3 dias.
2. Coloração de imunofluorescência
   1. Aspire o REEM e adicione 1 mL/poço de solução de colheita de organoide pré-resfriada nas placas de 12 poços. Incube no gelo por 40-60 min.
   2. Recolher os organoides com uma pipeta Pasteur e centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
   3. Enxágue os organoides 2-3x com PBS.
   4. Fixe os organoides com paraformaldeído a 4% por 20 min e bloqueie com BSA a 5% por 60 min.
      NOTA: Lave 2x com PBS antes e depois de cada etapa.
   5. Incubar os organoides durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em 1% de BSA.
   6. Incubar os organoides com anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente.
   7. Contra-corar os organoides com 200 μL de DAPI.
   8. Capture imagens usando um microscópio confocal invertido.
3. Coloração HE
   1. Desidratar os organoides através de uma série graduada de etanol: etanol 70% por 30 min; Etanol a 80% por 30 min; Etanol 95% por 30 min; Etanol 100% por 2 x 30 min. Limpe os organoides mergulhando-os em xileno por 2 x 30 min.
   2. Mergulhar os organoides limpos em parafina derretida a 60 °C durante 1 h. Transfira os organoides infiltrados em parafina para moldes de incorporação, encha os moldes com parafina derretida e coloque os moldes em uma placa fria para que a parafina solidifique. Remova os blocos de parafina dos moldes depois que a parafina solidificar e apare o excesso de parafina.
   3. Monte os blocos de parafina no micrótomo. Corte seções de 5 μm de espessura e flutue-as em banho-maria morna (42-45 °C) para aplainar. Transfira cuidadosamente as seções para lâminas de vidro e seque-as em um aquecedor de lâminas.
   4. Desparafinize as seções imergindo as lâminas em xileno por 2 x 5 min. Reidratar através de uma série de etanol graduado: 100% etanol por 2 x 3 min; Etanol a 95% por 3 min; Etanol 70% por 3 min; enxágüe em água destilada.
   5. Coloração com hematoxilina por 5 min; Em seguida, enxágue em água corrente da torneira por 5 min. Diferencie em álcool ácido a 1% por alguns segundos; enxágue em água corrente da torneira por 5 min; colocar em azul em água com amônia a 0,2% por 30 s; enxágue em água corrente da torneira por 5 min; corar com eosina por 2 min. Desidratar através de etanol graduado: etanol 70% por 1 min; Etanol a 95% por 1 min; 100% etanol por 2 x 1 min. Limpe em xileno por 2 x 1 min.
   6. Adicione uma gota de meio de montagem às seções manchadas. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a seção de tecido, evitando bolhas de ar. Observe as seções coradas sob um microscópio óptico.
4. Coloração de fluorescência
   1. Realize a desparafinização e a reidratação conforme descrito nas etapas 4.3.1. ao ponto 4.3.4.
   2. Pré-aqueça a solução de recuperação de antígeno em um forno de micro-ondas. Coloque as lâminas na solução de recuperação de antígeno aquecida e mantenha-as em temperatura de sub-ebulição por 20 min. Deixar arrefecer as lâminas na solução de recuperação de antigénios durante 40 min. Enxágue as lâminas em água deionizada por 5 min.
   3. Incube as lâminas em peróxido de hidrogênio a 0,3% em metanol por 10 min para extinguir a atividade da peroxidase endógena. Enxágue as lâminas por 3 x 5 min em PBS e incube-as em solução de bloqueio por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Retire o excesso de solução de bloqueio, mas não enxágue.
   4. Diluir o anticorpo primário na solução de bloqueio de acordo com as instruções do fabricante. Aplicar o anticorpo primário diluído nas secções de tecido e incubar durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.
   5. Lave as lâminas por 3 x 5 min em PBS. Diluir o anticorpo secundário conjugado com HRP em solução de bloqueio de acordo com as instruções do fabricante. Aplique o anticorpo secundário diluído nas seções de tecido e incube por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Lave as lâminas por 3 x 5 min em PBS para remover o anticorpo secundário não ligado.
   6. Prepare a solução de trabalho de tiramida fluoresceína de acordo com as instruções do kit. Aplique a solução de trabalho nas seções de tecido e incube por 15 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Enxágue as lâminas por 3 x 5 min em PBS.
   7. Repita a etapa 4.4.1. a 4.4.5 até que a coloração tenha sido concluída com os três anticorpos. Aplique uma gota de meio de montagem fluorescente com DAPI em cada seção de tecido. Coloque cuidadosamente uma lamínula sobre a seção de tecido para evitar bolhas de ar. Examine o microscópio confocal invertido de lâminas.
5. PCR quantitativo
   1. Recolha os organoides conforme descrito nos passos 4.2.1. ao ponto 4.2.3. Aspire o PBS e extraia os RNAs totais dos organoides seguindo as instruções do fabricante.
   2. Use qualquer kit de transcrição reversa disponível comercialmente para sintetizar cDNA a partir de 1 μg de RNA total. Configure uma reação q-PCR de acordo com o protocolo do fabricante do kit. Consulte a Tabela de Materiais para sequências de primers usadas para q-PCR.

5. Cultura de longo prazo de organoides endometriais de ratos

1. Aspire o REEM e adicione 1 mL de solução de colheita de organoides por 40 min para dissociar os organoides. Incube no gelo para manter a integridade do organoide.
2. Após a incubação, recolher os organoides utilizando uma pipeta Pasteur e centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C para os tornar em pellet para posterior processamento.
   NOTA: O corte da ponta da pipeta pode ser útil para manusear organoides maiores (acima de 500 μm) sem causar danos.
3. Ressuspenda os organoides peletizados em Matrigel, na proporção de 1:2 ou 1:3, para incorporação e posterior cultura em placas de 12 poços.
4. Prepare a solução de estoque congelada: REEM com 10% de DMSO.
5. Colha os organoides, ressuspenda-os na solução de estoque congelada e armazene-os em um freezer a -80 ° C ou em nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.
6. Para descongelar os organoides congelados, pré-aqueça o REEM em banho-maria a 37 °C e mergulhe o tubo de estoque congelado no banho-maria para descongelar suavemente os organoides.
7. Após o descongelamento, ressuspenda os organoides em 500 μL de Matrigel para reincorporação e cultura em uma placa de 12 poços. Siga as etapas 4.1.2. ao ponto 4.1.3.
   NOTA: É aconselhável armazenar organoides congelados a -80 °C por períodos mais curtos ou transferir para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

6. Opcional: Transição de organoides para cultura aderente

NOTA: O protocolo menciona um método alternativo para a obtenção de reESCs de cultura plana por meio da transição de organoides para cultura aderente, permitindo a reestruturação da morfologia do organoide.

1. Aspire o REEM e adicione 1 mL de solução de colheita de organoides para dissociar os organoides. Incube no gelo para manter a integridade do organoide.
2. Após a incubação, recolher os organoides utilizando uma pipeta Pasteur e centrifugar para os peletar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Ressuspenda os organoides em 3 mL de REEM pré-aquecido e transfira os organoides ressuspensos para um prato de 3,5 cm. Troque a mídia REEM a cada 2 dias.
4. Quando as células atingirem 70% de confluência, digeri-las com 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA por 5-6 min.
5. Reconstrua os organoides com reESCs seguindo as etapas 4.1.1 a 4.1.3.

7. Cultura sequencial de organoides com estradiol (E₂) e progesterona (P₄)

1. Preparar soluções-mãe de E₂ e P₄ em DMSO. Diluir as soluções-mãe até às concentrações de trabalho desejadas (E₂: 10 nM; P₄: 1 μM) em REEM, garantindo que a concentração final de DMSO não exceda 0,1% para evitar efeitos citotóxicos.
2. Organoides de cultura no REEM conforme as etapas 4.1.1. ao ponto 4.1.3. por 4 dias. Substituir o meio por REEM suplementado com E₂ e cultivar durante 7 dias. Monitore o crescimento e a morfologia dos organoides diariamente. Troque o meio a cada 2-3 dias.
3. Substituir o meio por REEM complementado com E₂ e P₄. Monitore o crescimento e a morfologia dos organoides diariamente. Troque o meio a cada 2-3 dias. Continue a cultivar os organoides por 7 dias.

Resultados

As reESCs e organoides do útero de ratas foram estabelecidos a partir de seis ratas Sprague-Dawley com peso entre 200 g e 250 g, seguindo o protocolo descrito na Figura 1. Com base no sucesso da cultura de longo prazo de células-tronco epiteliais endometriais humanas, a formulação REEM consistiu predominantemente em Y27632, A8301 e CHIR99021. Para estabilizar as reESCs in vitro, inicialmente isolamos células endometriais do endométrio de ratos...

Discussão

Neste estudo, descrevemos um método simples para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais de ratos (reESCs) e refinamos o sistema ex vivo previamente estabelecido para células-tronco epiteliais endometriais humanas⁸. Nossa abordagem utiliza um meio de cultura de moléculas pequenas contendo Y27632, A8301 e CHIR99021 como componentes principais para permitir uma cultura ex vivo estável e de longo prazo. Além disso, geramos com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG