Generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC), generando organoidi endometriali di ratto. Questo metodo facilita gli studi in vitro delle malattie dell'endometrio, consentendo l'editing genetico e altre manipolazioni cellulari.

Abstract

Gli organoidi endometriali offrono preziose informazioni sullo sviluppo e la fisiopatologia delle malattie endometriali e fungono da piattaforme per i test farmacologici. Sebbene siano stati sviluppati organoidi endometriali umani e di topo, la ricerca sugli organoidi endometriali di ratto rimane limitata. Dato che i ratti possono simulare meglio alcune patologie endometriali, come le aderenze intrauterine, questo studio mirava a stabilire organoidi endometriali di ratto. Presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) e la generazione di organoidi endometriali di ratto. Utilizzando un terreno di espansione reESCs raffinato, abbiamo isolato con successo e ampliato stabilmente le reESCs, dimostrando il loro potenziale di coltura a lungo termine. Gli organoidi generati da reESC hanno mostrato caratteristiche strutturali e funzionali tipiche dell'endometrio, inclusa la risposta ormonale. I nostri risultati hanno mostrato che gli organoidi endometriali di ratto possono essere coltivati a lungo termine con una proliferazione stabile, mantenendo la struttura ghiandolare, la polarità cellulare e le caratteristiche funzionali dell'epitelio endometriale. Questo nuovo modello di organoide endometriale derivato dal ratto fornisce una piattaforma preziosa per lo studio delle malattie endometriali e la sperimentazione di interventi terapeutici, con potenziali applicazioni in varie specie di mammiferi.

Introduzione

L'endometrio, un tessuto versatile e rigenerativo del corpo umano, subisce periodicamente la caduta, la rigenerazione e la differenziazione sotto l'influenza degli ormoni ovarici¹. Le anomalie dell'endometrio sono legate a varie malattie del sistema riproduttivo femminile, come l'endometriosi, il cancro dell'endometrio e l'infertilità². La mancanza di modelli di ricerca affidabili per l'endometrio ostacola studi approfonditi sulla patogenesi, la diagnosi clinica e il trattamento di queste malattie. Mentre le linee cellulari e i modelli animali sono comunemente utilizzati per la ricerca sull'endometrio, sfide come l'instabilità fenotipica nelle linee cellulari, le differenze interspecie nei modelli animali e altre limitazioni rendono difficile replicare la complessa struttura fisiologica e i cambiamenti funzionali dinamici nell'endometrio umano³.

Gli organoidi sono strutture tridimensionali formate dalla coltura di cellule staminali in un ambiente extracellulare, dotate di capacità di autorinnovamento e auto-organizzazione. Possono imitare la struttura e la funzione di tessuti fisiologici e patologici e sono riconosciuti come modelli preclinici di malattie umane⁴. Nel 2017, la costruzione di organoidi endometriali umani e di topo è stata ottenuta incorporando tessuto endometriale libero frammentato ottenuto attraverso la digestione enzimatica in un'impalcatura di matrice extracellulare, seguita dall'aggiunta di una miscela di fattori di crescita specifici e fattori di segnalazione per la coltivazione⁵. I risultati hanno dimostrato che gli organoidi endometriali ex vivo mostrano una capacità proliferativa stabile e a lungo termine, mantenendo la struttura ghiandolare, la polarità cellulare e le caratteristiche funzionali dell'epitelio endometriale, tra cui la secrezione di muco e la risposta ormonale⁶. Tuttavia, la coltura ex vivo di cellule staminali adulte che formano gli organoidi endometriali richiede un supporto strutturale simile a quello di una ghiandola, portando a sfide come la perdita di staminalità e difficoltà nel passaggio⁷.

Attualmente, la coltivazione di organoidi endometriali si basa sul metodo della coltura di digestione a blocchi di tessuto. In uno studio precedente, il nostro team di ricerca ha coltivato cellule staminali epiteliali endometriali umane per un periodo prolungato in vitro utilizzando un terreno di coltura primario composto principalmente da Y27632, che abbiamo impiegato per costruire organoidi endometriali⁸. Sulla base di questo successo, abbiamo isolato e coltivato cellule staminali epiteliali endometriali dal tessuto endometriale di ratto utilizzando un terreno di coltura composto da piccole molecole, stabilendo un sistema di coltura in vitro a lungo termine. Inoltre, abbiamo utilizzato cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) per generare organoidi endometriali di ratto. Lo sviluppo di questo modello migliorerà i futuri studi in vitro e in vivo sulle malattie correlate all'endometrio in combinazione con modelli di ratto.

Protocollo

In questo lavoro sono stati utilizzati sei ratti femmina di Sprague-Dawley di 7/8 settimane del peso di 200-250 g. I ratti sono stati alloggiati in una struttura climatizzata per animali con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale per gli esperimenti sugli animali presso il Comitato etico per la ricerca dell'ospedale popolare di Meizhou.

La sezione seguente delinea il processo per isolare, passare, congelare e scongelare le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto utilizzando un raffinato mezzo di espansione reESCs (REEM) composto principalmente da Y27632, A8301 e CHIR990217 ^8,9. La formulazione di REEM si basa su DMEM/F12 privo di siero arricchito con concentrazioni specifiche di componenti chiave: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 e 0,5 μM A8301. I dettagli completi sui componenti sono disponibili nella tabella dei materiali. Una volta che i ratti sono stati anestetizzati con inalazione di isoflurano, dovrebbero essere implementate le successive procedure illustrate nella Figura 1.

1. Procedura chirurgica

1. Anestetizzare il ratto mediante inalazione di isoflurano.
   1. Metti i ratti in una camera di induzione riempita con isoflurano al 3-5% mescolato con ossigeno. Confermare la corretta anestesia dall'assenza di una risposta a un pizzicamento del dito del piede e dalla perdita del riflesso raddrizzante.
   2. Una volta anestetizzati, mantenere i ratti sotto l'1-3% di isoflurano attraverso un cono nasale durante la procedura. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre il ratto è sotto anestesia.
2. Praticare un'incisione bassa della linea mediana addominale per esporre le corna dell'utero.
   NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati prima dell'uso. L'area chirurgica del ratto viene rasata e disinfettata con una soluzione antisettica. Il chirurgo indossa guanti sterili, una maschera e un camice. La procedura chirurgica viene eseguita su un telo sterile.
3. Eseguire incisioni longitudinali su entrambi i lati dell'utero per esporre l'endometrio interno. Usa una lama di bisturi T10 per raschiare l'endometrio fino a quando la superficie non è ruvida.
4. Dopo la procedura chirurgica, trasferire i ratti in un'area di recupero sterile e calda con livelli di temperatura e umidità regolati e monitorarli attentamente fino a quando non riacquistano piena coscienza e possono sostenersi in una posizione sdraiata sternale. Ospitare gruppi di tre ratti post-operatori separatamente in gabbie separate. Per alleviare il dolore post-chirurgico, somministrare analgesici come la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, per via sottocutanea); Ripetere ogni 8-12 ore per un massimo di 48-72 ore secondo necessità.

2. Lavorazione dei tessuti

1. Metti tutti i frammenti di endometrio uterino in un piatto da 3,5 cm e lavali 3 volte con PBS.
2. Miscelare i frammenti di endometrio uterino con 3 mL di collagenasi all'1% di tipo I (diluito in tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA) a 37 °C per 60 min. Filtrare il tessuto non digerito utilizzando un colino cellulare da 100 μm per isolare e raccogliere il filtrato per un'ulteriore coltivazione.
3. Seminare le cellule raccolte in piastre a 12 pozzetti in terreno REEM per un'ulteriore coltivazione. Calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per seminare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti per ottenere la densità cellulare desiderata (tipicamente ~1-2 × 10⁵ cellule/pozzetto in 1,5 mL di REEM).
4. Lavare le cellule raccolte al punto 2.2 per 3 volte con PBS. Dopo il lavaggio iniziale, centrifugare le celle a 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante; risospendere il pellet cellulare in PBS contenente l'1% di BSA (albumina sierica bovina) per ridurre al minimo il legame aspecifico e incubare per 15-30 minuti su ghiaccio.
5. Incubare le cellule con anticorpi primari specifici per diversi marcatori (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti a 1 ora a 4 °C. Diluire gli anticorpi in PBS con l'1% di BSA secondo le istruzioni del produttore.
6. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 600 μL di PBS con l'1% di BSA per l'analisi di citometria a flusso.
7. Configurare lo strumento con laser e filtri appropriati per i fluorofori utilizzati nell'esperimento (ad esempio, FITC, PE, APC). Utilizzare le impostazioni di diffusione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) per eseguire il gate sulla popolazione di singole cellule vive, esclusi detriti e aggregati cellulari. Calibrare il citometro a flusso utilizzando un controllo non colorato per garantire il corretto allineamento. Impostare gate specifici in base al controllo non colorato per definire popolazioni positive per ogni marcatore di interesse (la soglia è 0,02%).

3. Coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto

1. Saggio di formazione di colonie
   NOTA: Questo test ha contribuito a determinare il terreno di coltura ottimale per le reESC.
   1. Seminare le reESC P0 in piastre a 6 pozzetti a una densità di 1.000 cellule/pozzetto e coltivarle per 14 giorni in REEM o REEM prive di A8301, Y27632 o CHIR99021.
   2. Trascorso il periodo di coltura, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente e successivamente colorarle con soluzione di cristallovioletto per altri 20 minuti.
   3. Quantifica il numero di cluster di cellule contenenti più di 50 cellule. Selezionare il terreno di coltura in base al quale il terreno supporta la crescita di cluster cellulari.
      NOTA: L'omissione di fattori specifici dal REEM ha comportato una diminuzione della capacità proliferativa dei reESC (Figura 1B, C). Sulla base di questi risultati, REEM è stato selezionato come terreno preferito per la coltura di reESC per ottimizzare le condizioni di coltura.
2. Cambia il REEM ogni 2 giorni. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, digerirle con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
3. Passaggio delle celle ad un rapporto di 1:3 in REEM.
4. Saggio di proliferazione
   1. Seminare le reESC P1, P7 e P14 in piastre da 96 pozzetti a una densità di 4 × 10³ cellule/pozzetto in 150 μL di REEM.
   2. Aggiungere 10 μL di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto dopo 24, 48, 72 e 96 ore di coltura, seguite da un'incubazione di 2 ore a 37 °C.
   3. Determinare il tasso di proliferazione misurando l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
5. Preparazione e utilizzo delle scorte congelate
   1. Preparare la soluzione madre congelata utilizzando REEM con DMSO al 10%.
   2. Raccogliere le reESC con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA.
   3. Risospendere il pellet cellulare in una soluzione madre congelata a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in provette.
   4. Congelare le provette prima a -80 °C e poi trasferirle in azoto liquido entro 24 ore.
      NOTA: Se si intende scongelare presto le cellule, si consiglia di conservare le celle congelate a -80 °C per una durata massima di 6 mesi.
   5. Preriscaldare il REEM a 37 °C.
   6. Recuperare i reESC congelati e immergerli in un bagnomaria a 37 °C per 1-2 minuti.
   7. Trasferire le reESC scongelate in piastre a 6 pozzetti con una densità di semina di 1 × 10⁵ cellule/pozzetto in REEM.
6. Colorazione in immunofluorescenza
   1. Seminare le reESC nella fase di crescita logaritmica su piastre u-Slide a 8 pozzetti a una densità di 2 × 10³ cellule per pozzetto e coltivarle in REEM.
   2. Quando le reESC raggiungono il 90% di confluenza, fissarle con paraformaldeide al 4% per 20 minuti. Lavare i reESC con PBS 2x prima e dopo il fissaggio.
   3. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% per 10 min.
   4. Bloccare le cellule con siero di capra al 30% diluito in albumina sierica bovina al 5% (BSA) per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i reESC con PBS 2x prima e dopo il blocco.
   5. Incubare le cellule con anticorpi primari (anti-SSEA-1 e anti-citocheratina) per 12 ore a 4 °C. Lavare le reESC con PBS 2x dopo l'incubazione.
   6. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le reESC con PBS 2x dopo l'incubazione.
   7. Controcolorare le cellule con 150 μL di DAPI per marcare tutti i nuclei.
   8. Cattura immagini delle cellule colorate utilizzando un microscopio confocale invertito.

4. Determinazione di organoidi endometriali di ratto da reESC

1. Generazione degli organoidi
   1. Quando le reESC raggiungono il 70% di confluenza, digerire le cellule con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
   2. Risospendere 5 × 10⁵ reESC in 500 μl di Matrigel scongelato e posizionarle in piastre a 12 pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C per 20 minuti per consentire la gelificazione.
   3. Una volta che la miscela cellula-Matrigel si è solidificata, aggiungere 1,5 mL/pozzetto di REEM per coprire il Matrigel. Cambia il REEM ogni 2-3 giorni.
2. Colorazione in immunofluorescenza
   1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL/pozzetto di soluzione preraffreddata per la raccolta di organoidi nelle piastre a 12 pozzetti. Incubare con ghiaccio per 40-60 minuti.
   2. Raccogliere gli organoidi con una pipetta Pasteur e centrifugare a 300 × g per 3 min a 4 °C.
   3. Sciacquare gli organoidi 2-3 volte con PBS.
   4. Fissare gli organoidi con paraformaldeide al 4% per 20 min e bloccare con BSA al 5% per 60 min.
      NOTA: Lavare 2 volte con PBS prima e dopo ogni passaggio.
   5. Incubare gli organoidi per una notte a 4 °C con anticorpi primari diluiti in BSA all'1%.
   6. Incubare gli organoidi con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
   7. Controcolorare gli organoidi con 200 μL di DAPI.
   8. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale invertito.
3. colorazione HE
   1. Disidratare gli organoidi attraverso una serie di etanolo graduato: etanolo al 70% per 30 minuti; 80% di etanolo per 30 min; etanolo al 95% per 30 min; 100% etanolo per 2 x 30 min. Eliminare gli organoidi immergendoli in xilene per 2 x 30 min.
   2. Immergere gli organoidi chiarificati in paraffina fusa a 60 °C per 1 ora. Trasferire gli organoidi infiltrati di paraffina negli stampi da incasso, riempire gli stampi con paraffina fusa e posizionare gli stampi in una piastra fredda per la solidificazione della paraffina. Rimuovere i blocchi di paraffina dagli stampi dopo che la paraffina si è solidificata e tagliare la paraffina in eccesso.
   3. Montare i blocchi di paraffina sul microtomo. Tagliare sezioni spesse 5 μm e farle galleggiare a bagnomaria calda (42-45 °C) per appiattirle. Trasferire con cura le sezioni su vetrini e asciugarle su uno scaldavetrini.
   4. Deparaffinare le sezioni immergendo i vetrini nello xilene per 2 x 5 min. Reidratare attraverso una serie di etanolo graduato: etanolo al 100% per 2 x 3 min; etanolo al 95% per 3 min; etanolo al 70% per 3 min; Sciacquare in acqua distillata.
   5. Colorare con ematossilina per 5 min; Quindi, sciacquare con acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Differenziare in alcool acido all'1% per alcuni secondi; sciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min; mettere in blu in acqua di ammoniaca allo 0,2% per 30 s; sciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min; Colorare con eosina per 2 min. Disidratare attraverso etanolo graduato: etanolo al 70% per 1 minuto; etanolo al 95% per 1 minuto; 100% etanolo per 2 x 1 min. Chiarificare in xilene per 2 x 1 min.
   6. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alle sezioni macchiate. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti sulla sezione di tessuto, evitando bolle d'aria. Osservare le sezioni colorate al microscopio ottico.
4. Colorazione a fluorescenza
   1. Eseguire la deparaffinazione e la reidratazione come descritto nei passaggi 4.3.1. al punto 4.3.4.
   2. Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene in un forno a microonde. Immergere i vetrini nella soluzione riscaldata per il recupero dell'antigene e mantenerli a temperatura inferiore all'ebollizione per 20 minuti. Lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene per 40 minuti. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 5 minuti.
   3. Incubare i vetrini in perossido di idrogeno allo 0,3% in metanolo per 10 minuti per estinguere l'attività della perossidasi endogena. Sciacquare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS e incubarli in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Picchiettare la soluzione bloccante in eccesso ma non risciacquare.
   4. Diluire l'anticorpo primario in soluzione bloccante secondo le istruzioni del produttore. Applicare l'anticorpo primario diluito sulle sezioni di tessuto e incubare per una notte a 4 °C in una camera umidificata.
   5. Lavare le diapositive per 3 x 5 minuti in PBS. Diluire l'anticorpo secondario coniugato HRP in soluzione bloccante secondo le istruzioni del produttore. Applicare l'anticorpo secondario diluito sulle sezioni di tessuto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Lavare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS per rimuovere l'anticorpo secondario non legato.
   6. Preparare la soluzione di lavoro Fluoresceina Tiramide secondo le istruzioni del kit. Applicare la soluzione di lavoro sulle sezioni di tessuto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS.
   7. Ripetere il passaggio 4.4.1. fino a quando la colorazione non è stata completata con tutti e tre gli anticorpi. Applicare una goccia di terreno di montaggio fluorescente con DAPI su ogni sezione di tessuto. Posizionare con cura un vetrino coprioggetti sulla sezione di tessuto per evitare bolle d'aria. Esaminare i vetrini al microscopio confocale invertito.
5. PCR quantitativa
   1. Raccogliere gli organoidi come descritto nei passaggi 4.2.1. al punto 4.2.3. Aspirare il PBS ed estrarre gli RNA totali dagli organoidi seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Utilizzare qualsiasi kit di trascrizione inversa disponibile in commercio per sintetizzare il cDNA da 1 μg di RNA totale. Impostare una reazione q-PCR secondo il protocollo del produttore del kit. Vedere la Tabella dei materiali per le sequenze di primer utilizzate per la q-PCR.

5. Coltura a lungo termine di organoidi endometriali di ratto

1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL di soluzione di raccolta degli organoidi per 40 minuti per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide.
2. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta Pasteur e centrifugare a 300 × g per 3 minuti a 4 °C per pellettarli per un'ulteriore lavorazione.
   NOTA: Il taglio del puntale della pipetta può essere utile per maneggiare organoidi più grandi (oltre 500 μm) senza causare danni.
3. Risospendere gli organoidi pellettati in Matrigel, in un rapporto di 1:2 o 1:3, per l'inclusione e la successiva coltura in piastre a 12 pozzetti.
4. Preparare la soluzione madre congelata: REEM con DMSO al 10%.
5. Raccogliere gli organoidi, risospenderli nella soluzione madre congelata e quindi conservarli in congelatore a -80 °C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
6. Per scongelare gli organoidi congelati, preriscaldare il REEM in un bagno d'acqua a 37 °C e immergere il tubo madre congelato nel bagnomaria per scongelare delicatamente gli organoidi.
7. Dopo lo scongelamento, risospendere gli organoidi in 500 μL di Matrigel per la reinclusione e la coltura in una piastra a 12 pozzetti. Seguire i passaggi 4.1.2. al punto 4.1.3.
   NOTA: Si consiglia di conservare gli organoidi congelati a -80 °C per periodi più brevi o di trasferirli in azoto liquido per una conservazione a lungo termine.

6. Facoltativo: transizione degli organoidi alla coltura aderente

NOTA: Il protocollo menziona un metodo alternativo per ottenere reESC in coltura piatta mediante la transizione degli organoidi alla coltura aderente, consentendo la ristrutturazione della morfologia degli organoidi.

1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL di soluzione di raccolta degli organoidi per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide.
2. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta Pasteur e centrifugarli per pellettarli a 300 × g per 3 minuti a 4 °C.
3. Risospendere gli organoidi in 3 mL di REEM preriscaldato e trasferire gli organoidi risospesi in un piatto di 3,5 cm. Cambia il supporto REEM ogni 2 giorni.
4. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, digerirle con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
5. Ricostruire gli organoidi con reESC seguendo i passaggi da 4.1.1 a 4.1.3.

7. Coltura sequenziale di organoidi con estradiolo (E₂) e progesterone (P₄)

1. Preparare le soluzioni madre di E₂ e P₄ in DMSO. Diluire le soluzioni madre alle concentrazioni di lavoro desiderate (E₂: 10 nM; P₄: 1 μM) in REEM, garantendo che la concentrazione finale di DMSO non superi lo 0,1% per evitare effetti citotossici.
2. Organoidi di coltura in REEM come fasi 4.1.1. al punto 4.1.3. per 4 giorni. Sostituire il terreno con REEM integrato con E₂ e coltura per 7 giorni. Monitora quotidianamente la crescita e la morfologia degli organoidi. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
3. Sostituire il fluido con REEM integrato con E₂ e P₄. Monitora quotidianamente la crescita e la morfologia degli organoidi. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni. Continuare a coltivare gli organoidi per 7 giorni.

Risultati

Le reESC e gli organoidi dell'utero di ratto sono stati stabiliti da sei femmine di ratto Sprague-Dawley di peso compreso tra 200 g e 250 g seguendo il protocollo delineato nella Figura 1. Attingendo al successo della coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali umane, la formulazione di REEM consisteva prevalentemente in Y27632, A8301 e CHIR99021. Per stabilizzare le reESC in vitro, abbiamo inizialmente isolato le cellule en...

Discussione

In questo studio, abbiamo descritto un metodo semplice per isolare e coltivare le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) e perfezionato il sistema ex vivo precedentemente stabilito per le cellule staminali epiteliali endometriali umane⁸. Il nostro approccio utilizza un terreno di coltura a piccola molecola contenente Y27632, A8301 e CHIR99021 come componenti principali per consentire una coltura ex vivo stabile e a lungo termi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG