Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

Özet

Burada, sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz, bu da sıçan endometriyal organoidleri üretiyor. Bu yöntem, endometriyal hastalıkların in vitro çalışmalarını kolaylaştırarak gen düzenlemesini ve diğer hücresel manipülasyonları mümkün kılar.

Özet

Endometriyal organoidler, endometriyal hastalıkların gelişimi ve patofizyolojisi hakkında değerli bilgiler sunar ve ilaç testi için platformlar olarak hizmet eder. İnsan ve fare endometriyal organoidleri geliştirilmiş olsa da, sıçan endometriyal organoidleri üzerine yapılan araştırmalar sınırlı kalmaktadır. Sıçanların intrauterin adezyonlar gibi belirli endometriyal patolojileri daha iyi simüle edebildiği göz önüne alındığında, bu çalışma sıçan endometriyal organoidlerini oluşturmayı amaçladı. Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin (reESC'ler) izolasyonu ve kültürü ve sıçan endometriyal organoidlerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Rafine bir reESC genişletme ortamı kullanarak, reESC'leri başarılı bir şekilde izole ettik ve istikrarlı bir şekilde genişleterek uzun vadeli kültür potansiyellerini gösterdik. ReESC ile üretilen organoidler, hormon duyarlılığı da dahil olmak üzere endometriyumun tipik yapısal ve fonksiyonel özelliklerini sergiledi. Sonuçlarımız, sıçan endometriyal organoidlerinin, glandüler yapıyı, hücre polaritesini ve endometriyal epitelin fonksiyonel özelliklerini koruyarak, stabil proliferasyon ile uzun bir süre boyunca kültürlenebileceğini gösterdi. Bu yeni sıçan türevli endometriyal organoid modeli, çeşitli memeli türlerinde potansiyel uygulamalarla birlikte endometriyal hastalıkları incelemek ve terapötik müdahaleleri test etmek için değerli bir platform sağlar.

Giriş

İnsan vücudunda çok yönlü ve yenileyici bir doku olan endometrium, yumurtalık hormonlarının etkisiyle periyodik olarak dökülme, yenilenme ve farklılaşma geçirir¹. Endometriyumdaki anormallikler, endometriozis, endometriyal kanser ve kısırlık gibi çeşitli kadın üreme sistemi hastalıklarıyla bağlantılıdır². Endometrium için güvenilir araştırma modellerinin olmaması, bu hastalıkların patogenez, klinik tanı ve tedavisi ile ilgili derinlemesine çalışmaları engellemektedir. Hücre hatları ve hayvan modelleri endometriyal araştırmalar için yaygın olarak kullanılırken, hücre dizilerindeki fenotipik kararsızlık, hayvan modellerindeki türler arası farklılıklar ve diğer sınırlamalar gibi zorluklar, insan endometriyumundaki karmaşık fizyolojik yapıyı ve dinamik fonksiyonel değişiklikleri tekrarlamayı zorlaştırmaktadır³.

Organoidler, kök hücrelerin hücre dışı bir ortamda kültürlenmesiyle oluşan, kendini yenileme ve kendi kendini organize etme yeteneklerine sahip üç boyutlu yapılardır. Fizyolojik ve patolojik dokuların yapısını ve işlevini taklit edebilirler ve insan hastalıklarının klinik öncesi modelleri olarak kabul edilirler⁴. 2017 yılında, fare ve insan endometriyal organoidlerinin başarılı bir şekilde inşası, enzimatik sindirim yoluyla elde edilen parçalanmış serbest endometriyal dokunun hücre dışı bir matris iskelesine gömülmesi ve ardından yetiştirme için spesifik büyüme faktörleri ve sinyal faktörlerinin bir karışımının eklenmesiyle elde edildi⁵. Sonuçlar, ex vivo endometriyal organoidlerin, mukus sekresyonu ve^{hormon yanıtı 6} dahil olmak üzere endometriyal epitelin glandüler yapısını, hücre polaritesini ve fonksiyonel özelliklerini koruyarak uzun süreli ve stabil proliferatif kapasite sergilediğini göstermiştir. Bununla birlikte, endometriyal organoidleri oluşturan yetişkin kök hücrelerin ex vivo kültürü, bez benzeri yapısal destek gerektirir ve bu da sap kaybı ve geçişte zorluklar gibi zorluklara yol açar⁷.

Şu anda, endometrial organoidlerin yetiştirilmesi, doku bloğu sindirim kültürü yöntemine dayanmaktadır. Önceki bir çalışmada, araştırma ekibimiz, endometriyal organoidleri oluşturmak için kullandığımız Y27632'den oluşan bir birincil kültür ortamı kullanarak in vitro olarak insan endometriyal epitel kök hücrelerini uzun bir süre boyunca kültürledi⁸. Bu başarıdan yola çıkarak, küçük moleküllü bir bileşik kültür ortamı kullanarak sıçan endometriyal dokusundan endometrial epitelyal kök hücreleri izole ettik ve kültürledik ve uzun süreli bir in vitro kültür sistemi kurduk. Ayrıca, sıçan endometriyal organoidleri oluşturmak için sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) kullandık. Bu modelin geliştirilmesi, sıçan modelleri ile birlikte endometriyal ilişkili hastalıkların gelecekteki in vitro ve in vivo çalışmalarını geliştirecektir.

Protokol

Bu çalışmada 200-250 g ağırlığında altı adet 7/8 haftalık dişi Sprague-Dawley sıçanı kullanıldı. Sıçanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan iklim kontrollü bir hayvan tesisine yerleştirildi. Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal Yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Meizhou Halk Hastanesi Araştırma Etik Komitesi'ndeki hayvan deneyleri için kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.

Aşağıdaki bölüm, esas olarak Y27632, A8301 ve CHIR990217 ^8,9'dan oluşan rafine bir reESC genişletme ortamı (REEM) kullanılarak sıçan endometriyal epitel kök hücrelerinin izole edilmesi, geçirilmesi, dondurulması ve çözülmesi sürecini özetlemektedir. REEM formülasyonu, anahtar bileşenlerin spesifik konsantrasyonları ile zenginleştirilmiş serumsuz DMEM / F12'ye dayanmaktadır: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 ve 0.5 μM A8301. Bileşenlerle ilgili kapsamlı ayrıntılar Malzeme Tablosunda bulunabilir. Sıçanlar izofluran inhalasyonu ile uyuşturulduktan sonra, Şekil 1'de gösterilen sonraki prosedürler uygulanmalıdır.

1. Cerrahi prosedür

1. İzofluran inhalasyonu ile sıçanı uyuşturun.
   1. Sıçanları, oksijenle karıştırılmış% 3-5 izofluran ile doldurulmuş bir indüksiyon odasına yerleştirin. Bir ayak parmağı tutamına yanıt olmaması ve doğru refleksin kaybı ile uygun anesteziyi onaylayın.
   2. Anestezi uygulandıktan sonra, işlem sırasında sıçanları bir burun konisi aracılığıyla% 1-3 izofluran altında tutun. Sıçan anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
2. Rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için düşük abdominal orta hat kesisi yapın.
   NOT: Tüm cerrahi aletler kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Sıçan üzerindeki cerrahi alan traş edilir ve antiseptik bir solüsyonla dezenfekte edilir. Cerrah steril eldiven, maske ve önlük giyer. Cerrahi işlem steril bir örtü üzerinde gerçekleştirilir.
3. İç endometriyumu ortaya çıkarmak için uterusun her iki tarafında uzunlamasına kesiler yapın. Yüzey pürüzlü olana kadar endometriyumu kazımak için bir T10 neşter bıçağı kullanın.
4. Cerrahi işlemden sonra, sıçanları düzenlenmiş sıcaklık ve nem seviyelerine sahip steril ve ılık bir iyileşme alanına aktarın ve tam bilinçlerini geri kazanana ve sternal yaslanmış pozisyonda kendilerini destekleyene kadar yakından izleyin. Ameliyat sonrası üç sıçandan oluşan ev gruplarını ayrı ayrı kafeslerde saklayın. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için buprenorfin gibi analjezikler uygulayın (deri altından 0.05-0.1 mg / kg); Gerektiğinde her 8-12 saatte bir 48-72 saate kadar tekrarlayın.

2. Doku işleme

1. Tüm uterus endometrium parçalarını 3,5 cm'lik bir tabağa koyun ve 3 kez PBS ile yıkayın.
2. Uterus endometriyum parçalarını 3 mL% 1 kollajenaz tip I (% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA içinde seyreltilmiş) ile 37 ° C'de 60 dakika karıştırın. Sindirilmemiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak süzün, daha fazla kültür için süzüntüyü izole etmek ve toplamak için.
3. Toplanan hücreleri, daha fazla kültür için REEM ortamında 12 oyuklu plakalara tohumlayın. İstenen hücre yoğunluğunu elde etmek için 12 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri tohumlamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın (tipik olarak ~ 1-2 × 10⁵ hücre / 1.5 mL REEM'de kuyu).
4. Adım 2.2'de toplanan hücreleri PBS ile 3x boyunca yıkayın. İlk yıkamadan sonra hücreleri 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın; spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için% 1 BSA (sığır serum albümini) içeren PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 15-30 dakika inkübe edin.
5. Hücreleri farklı belirteçlere özgü birincil antikorlarla ( Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 30 dakika ila 1 saat inkübe edin. PBS'deki antikorları, üreticinin talimatlarına göre% 1 BSA ile seyreltin.
6. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için hücreleri 2x PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, akış sitometrisi analizi için hücreleri %1 BSA ile 600 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Cihazı, deneyde kullanılan floroforlara uygun lazerler ve filtrelerle yapılandırın (örn. FITC, PE, APC). Enkaz ve hücre agregaları hariç olmak üzere canlı, tek hücreli popülasyonu geçmek için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) ayarlarını kullanın. Doğru hizalamayı sağlamak için lekesiz bir kontrol kullanarak akış sitometresini kalibre edin. İlgilenilen her belirteç için pozitif popülasyonları tanımlamak için boyanmamış kontrole dayalı belirli kapılar ayarlayın (eşik %0,02'dir).

3. Sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin uzun süreli kültürü

1. Koloni oluşumu deneyi
   NOT: Bu tahlil, reESC'ler için en uygun kültür ortamının belirlenmesine yardımcı olmuştur.
   1. P0 reESC'leri 1.000 hücre / kuyucuk yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve bunları A8301, Y27632 veya CHIR99021 içermeyen REEM veya REEM'de 14 gün boyunca kültürleyin.
   2. Kültür süresinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve ardından 20 dakika daha kristal viyole çözeltisi ile boyayın.
   3. 50'den fazla hücre içeren hücre kümelerinin sayısını ölçün. Hangi ortamın hücre kümelerinin büyümesini desteklediğine bağlı olarak kültür ortamını seçin.
      NOT: REEM'den belirli faktörlerin ihmal edilmesi, reESC'lerin proliferatif kapasitesinin azalmasına neden olmuştur (Şekil 1B, C). Bu bulgulara dayanarak, kültür koşullarını optimize etmek için reESC kültürü için tercih edilen ortam olarak REEM seçilmiştir.
2. REEM'i her 2 günde bir değiştirin. Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında, bunları %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile 5-6 dakika sindirin.
3. Hücreleri REEM'de 1:3 oranında geçirin.
4. Proliferasyon testi
   1. P1, P7 ve P14 reESC'leri 150 μL REEM'de 4 ×^{10 3} hücre / kuyu yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara tohumlayın.
   2. 24, 48, 72 ve 96 saat kültürden sonra her bir oyuğa 10 μL CCK-8 reaktifi ekleyin, ardından 37 ° C'de 2 saatlik bir inkübasyon yapın.
   3. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nm'de absorbansı ölçerek proliferasyon oranını belirleyin.
5. Dondurulmuş stokların hazırlanması ve kullanılması
   1. Dondurulmuş stok çözeltisini %10 DMSO ile REEM kullanarak hazırlayın.
   2. ReESC'leri %0,25 tripsin / 1 mM EDTA ile hasat edin.
   3. Hücre peletini donmuş stok çözeltisinde 1 × 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu tüplere aktarın.
   4. Tüpleri önce -80 °C'de dondurun ve ardından 24 saat içinde sıvı nitrojene aktarın.
      NOT: Hücrelerin yakın zamanda çözülmesi planlanıyorsa, donmuş hücrelerin -80 °C'de en fazla 6 ay süreyle saklanması önerilir.
   5. REEM'i önceden 37 °C'ye ısıtın.
   6. Dondurulmuş reESC'leri alın ve 1-2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna daldırın.
   7. Çözülmüş reESC'leri REEM'de 1 × 10⁵ hücre/kuyu tohumlama yoğunluğuna sahip 6 oyuklu plakalara aktarın.
6. İmmünofloresan boyama
   1. Logaritmik büyüme fazındaki reESC'leri, oyuk başına 2 × 10³ hücre yoğunluğunda u-Slide 8 oyuklu plakalara tohumlayın ve bunları REEM'de kültürleyin.
   2. ReESC'ler %90 birleşime ulaştığında, 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksasyondan önce ve sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
   3. Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
   4. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA) içinde seyreltilmiş% 30 keçi serumu ile bloke edin. ReESC'leri blokajdan önce ve sonra PBS 2x ile yıkayın.
   5. Hücreleri birincil antikorlarla (anti-SSEA-1 ve anti-Sitokeratin) 4 ° C'de 12 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
   6. Hücreleri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra reESC'leri PBS 2x ile yıkayın.
   7. Tüm çekirdekleri etiketlemek için hücreleri 150 μL DAPI ile boyayın.
   8. Ters konfokal mikroskop kullanarak lekeli hücrelerin görüntülerini yakalayın.

4. ReESC'lerden sıçan endometriyal organoidlerinin oluşturulması

1. Organoidlerin oluşumu
   1. ReESC'ler %70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile 5-6 dakika sindirin.
   2. 500 μL çözülmüş Matrigel içinde 5 ×^{10 5} reESC'yi yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu plakalara yerleştirin. Jelleşmeyi sağlamak için plakaları 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
   3. Hücre-Matrigel karışımı katılaştıktan sonra, Matrigel'i kaplamak için 1.5 mL/kuyu REEM ekleyin. REEM'i her 2-3 günde bir değiştirin.
2. İmmünofloresan boyama
   1. REEM'i aspire edin ve 12 oyuklu plakalara 1 mL / kuyu önceden soğutulmuş Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Buz üzerinde 40-60 dakika inkübe edin.
   2. Organoidleri bir Pasteur pipeti ile toplayın ve 300 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
   3. Organoidleri 2-3x PBS ile durulayın.
   4. Organoidleri 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin ve 60 dakika boyunca %5 BSA kullanarak bloke edin.
      NOT: Her adımdan önce ve sonra PBS ile 2 kez yıkayın.
   5. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve% 1 BSA'da seyreltilmiş birincil antikorlarla.
   6. Organoidleri ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   7. Organoidleri 200 μL DAPI ile boyayın.
   8. Ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak görüntü yakalayın.
3. HE boyama
   1. Organoidleri kademeli bir etanol serisi ile kurutun: 30 dakika boyunca% 70 etanol; 30 dakika boyunca% 80 etanol; 30 dakika boyunca% 95 etanol; 2 x 30 dakika boyunca% 100 etanol. Organoidleri 2 x 30 dakika ksilene batırarak temizleyin.
   2. Temizlenmiş organoidleri 1 saat boyunca 60 ° C'de erimiş parafine daldırın. Parafin ile sızan organoidleri gömme kalıplarına aktarın, kalıpları erimiş parafin ile doldurun ve parafinin katılaşması için kalıpları soğuk bir plakaya yerleştirin. Parafin katılaştıktan sonra parafin bloklarını kalıplardan çıkarın ve fazla parafini kesin.
   3. Parafin bloklarını mikrotom üzerine monte edin. 5 μm kalınlığında bölümler kesin ve düzleştirmek için ılık su banyosunda (42-45 °C) yüzdürün. Bölümleri dikkatlice cam slaytlara aktarın ve bir slayt ısıtıcısında kurutun.
   4. Slaytları 2 x 5 dakika boyunca ksilene batırarak bölümleri deparafinize edin. Bir dizi dereceli etanol ile rehidrat: 2 x 3 dakika boyunca% 100 etanol; 3 dakika boyunca% 95 etanol; 3 dakika boyunca% 70 etanol; Damıtılmış suda durulayın.
   5. 5 dakika hematoksilen ile boyayın; Ardından akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Birkaç saniye% 1 asit alkolde farklılaştırın; akan musluk suyunda 5 dakika durulayın; 30 saniye boyunca% 0.2 amonyaklı suda mavi olarak yerleştirin; akan musluk suyunda 5 dakika durulayın; 2 dakika boyunca Eozin ile boyayın. Dereceli etanol ile dehidrat: 1 dakika boyunca% 70 etanol; 1 dakika boyunca% 95 etanol; 2 x 1 dakika boyunca% 100 etanol. 2 x 1 dakika ksilen içinde temizleyin.
   6. Lekeli bölümlere bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, hava kabarcıklarından kaçınarak doku bölümünün üzerine bir lamel yerleştirin. Lekeli bölümleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
4. Floresan boyama
   1. Adım 4.3.1'de açıklandığı gibi deparafinizasyon ve rehidrasyon gerçekleştirin. 4.3.4'e kadar.
   2. Antijen alma solüsyonunu bir mikrodalga fırında önceden ısıtın. Slaytları ısıtılmış antijen alma çözeltisine yerleştirin ve 20 dakika boyunca kaynama sıcaklığının altında tutun. Slaytların antijen toplama solüsyonunda 40 dakika soğumasına izin verin. Slaytları deiyonize suda 5 dakika durulayın.
   3. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için slaytları metanol içinde% 0.3 hidrojen peroksit içinde 10 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika durulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici solüsyonda inkübe edin. Fazla engelleme solüsyonunu hafifçe vurun, ancak durulamayın.
   4. Birincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici çözelti içinde seyreltin. Seyreltilmiş primer antikoru doku kesitlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın. HRP ile konjuge ikincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici çözelti içinde seyreltin. Seyreltilmiş ikincil antikoru doku bölümlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için slaytları PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
   6. Floresein Tyramide çalışma solüsyonunu kitin talimatlarına göre hazırlayın. Çalışma solüsyonunu doku bölümlerine uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
   7. Adım 4.4.1'i tekrarlayın. üç antikorun tümü ile boyama tamamlanana kadar 4.4.5'e kadar. Her doku bölümüne DAPI ile bir damla floresan montaj ortamı uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için doku bölümünün üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin. Slaytları ters konfokal mikroskopta inceleyin.
5. Kantitatif PCR
   1. Organoidleri adım 4.2.1'de açıklandığı gibi toplayın. 4.2.3'e kadar. PBS'yi aspire edin ve üreticinin talimatlarını izleyerek organoidlerden toplam RNA'ları çıkarın.
   2. 1 μg toplam RNA'dan cDNA'yı sentezlemek için ticari olarak mevcut herhangi bir ters transkripsiyon kitini kullanın. Kit üreticisinin protokolüne göre bir q-PCR reaksiyonu ayarlayın. q-PCR için kullanılan primer dizileri için Malzeme Tablosuna bakınız.

5. Sıçan endometriyal organoidlerinin uzun süreli kültürü

1. REEM'i aspire edin ve organoidleri ayırmak için 40 dakika boyunca 1 mL Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Organoid bütünlüğünü korumak için buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
2. İnkübasyondan sonra, organoidleri bir Pasteur pipeti kullanarak toplayın ve daha sonraki işlemler için peletlemek için 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
   NOT: Pipet ucunun kırpılması, daha büyük organoidlerin (500 μm'den fazla) hasara neden olmadan taşınması için yardımcı olabilir.
3. Peletlenmiş organoidleri, 12 oyuklu plakalara gömmek ve daha sonra kültür yapmak için Matrigel içinde 1: 2 veya 1: 3 oranında yeniden süspanse edin.
4. Dondurulmuş stok çözeltisini hazırlayın:% 10 DMSO ile REEM.
5. Organoidleri hasat edin, donmuş stok çözeltisinde yeniden süspanse edin ve ardından uzun süreli koruma için -80 ° C'de bir dondurucuda veya sıvı nitrojen içinde saklayın.
6. Donmuş organoidleri çözmek için, REEM'i 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın ve organoidleri nazikçe çözmek için donmuş stok tüpünü su banyosuna daldırın.
7. Çözüldükten sonra, organoidleri 12 oyuklu bir plakaya yeniden gömmek ve kültür etmek için 500 μL Matrigel içinde yeniden süspanse edin. 4.1.2 adımlarını izleyin. 4.1.3'e kadar.
   NOT: Dondurulmuş organoidlerin daha kısa süreler için -80 °C'de saklanması veya daha uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarılması tavsiye edilir.

6. İsteğe bağlı: Organoidlerin yapışkan kültüre geçirilmesi

NOT: Protokol, organoidleri yapışık kültüre geçirerek düz kültürlenmiş reESC'ler elde etmek için alternatif bir yöntemden bahseder ve organoid morfolojisinin yeniden yapılandırılmasına izin verir.

1. REEM'i aspire edin ve organoidleri ayırmak için 1 mL Organoid Hasat Çözeltisi ekleyin. Organoid bütünlüğünü korumak için buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
2. İnkübasyondan sonra, organoidleri bir Pasteur pipeti kullanarak toplayın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da pelet yapmak için santrifüjleyin.
3. Organoidleri 3 mL önceden ısıtılmış REEM içinde yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş organoidleri 3,5 cm'lik bir tabağa aktarın. REEM ortamını 2 günde bir değiştirin.
4. Hücreler %70 birleşmeye ulaştığında, bunları 5-6 dakika boyunca %0.25 tripsin / 1 mM EDTA ile sindirin.
5. 4.1.1 ila 4.1.3 arasındaki adımları izleyerek organoidleri reESC'lerle yeniden yapılandırın.

7. Organoidlerin estradiol (_E2) ve progesteron (P₄) ile sıralı kültürü

1. DMSO'da E₂ ve P₄ stok çözeltilerini hazırlayın. Stok çözeltilerini istenen çalışma konsantrasyonlarına (E₂: 10 nM; P₄: 1 μM) REEM'de, sitotoksik etkilerden kaçınmak için nihai DMSO konsantrasyonunun% 0.1'i geçmemesini sağlar.
2. Adım 4.1.1 olarak REEM'de kültür organoidleri. 4.1.3'e kadar. 4 gün boyunca. Ortamı_E2 ile takviye edilmiş REEM ile değiştirin ve 7 gün boyunca kültür. Organoid büyümesini ve morfolojisini günlük olarak izleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.
3. Ortamı_E2 ve P₄ ile takviye edilmiş REEM ile değiştirin. Organoid büyümesini ve morfolojisini günlük olarak izleyin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin. Organoidleri 7 gün boyunca kültürlemeye devam edin.

Sonuçlar

ReESC'ler ve sıçan uterus organoidleri, Şekil 1'de belirtilen protokolü takiben 200 g ile 250 g arasında değişen altı dişi Sprague-Dawley sıçanından oluşturulmuştur. İnsan endometriyal epitelyal kök hücrelerinin uzun vadeli kültürünün başarısından yararlanan REEM formülasyonu ağırlıklı olarak Y27632, A8301 ve CHIR99021'den oluşuyordu. ReESC'leri in vitro olarak stabilize etmek için, başlangıçta enzimatik ve mekanik ...

Tartışmalar

Bu çalışmada, sıçan endometriyal epitel kök hücrelerinin (reESC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için basit bir yöntem tanımladık ve insan endometriyal epitel kök hücreleri için daha önce kurulmuş olan ex vivo sistemi rafine ettik⁸. Yaklaşımımız, kararlı ve uzun vadeli ex vivo kültürü mümkün kılmak için temel bileşenler olarak Y27632, A8301 ve CHIR99021 içeren küçük bir molekül kültür ortamı kullanır. A...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG