יצירה ואפיון של אורגנואידים ברחם חולדה מתאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs), המייצרים אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. שיטה זו מקלה על מחקרי מבחנה של מחלות רירית הרחם, ומאפשרת עריכת גנים ומניפולציות תאיות אחרות.

Abstract

אורגנואידים של רירית הרחם מציעים תובנות חשובות לגבי ההתפתחות והפתופיזיולוגיה של מחלות רירית הרחם ומשמשים כפלטפורמות לבדיקת תרופות. בעוד שפותחו אורגנואידים של רירית הרחם בבני אדם ובעכברים, המחקר על אורגנואידים של רירית הרחם בחולדות נותר מוגבל. בהתחשב בכך שחולדות יכולות לדמות טוב יותר פתולוגיות מסוימות של רירית הרחם, כגון הידבקויות תוך רחמיות, מחקר זה נועד לבסס אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד ותרבית של תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs) ויצירת אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. באמצעות מדיום הרחבה מעודן, בודדנו בהצלחה והרחבנו ביציבות reESCs, והדגמנו את פוטנציאל התרבות ארוך הטווח שלהם. האורגנואידים שנוצרו על ידי reESC הציגו מאפיינים מבניים ותפקודיים אופייניים של רירית הרחם, כולל היענות להורמונים. התוצאות שלנו הראו כי ניתן לתרבת אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות לטווח ארוך עם התפשטות יציבה, תוך שמירה על מבנה הבלוטות, קוטביות התאים והמאפיינים התפקודיים של אפיתל רירית הרחם. מודל אורגנואיד רירית הרחם החדשני שמקורו בחולדות מספק פלטפורמה רבת ערך לחקר מחלות רירית הרחם ולבדיקת התערבויות טיפוליות, עם יישומים פוטנציאליים על פני מיני יונקים שונים.

Introduction

רירית הרחם, רקמה רב-תכליתית ומתחדשת בגוף האדם, עוברת נשירה, התחדשות והתמיינות תקופתית בהשפעת הורמוני השחלות¹. חריגות ברירית הרחם קשורות למחלות שונות במערכת הרבייה הנשית, כגון אנדומטריוזיס, סרטן רירית הרחם ואי פוריות². היעדר מודלים מחקריים אמינים לרירית הרחם פוגע במחקרים מעמיקים של הפתוגנזה, האבחון הקליני והטיפול במחלות אלו. בעוד שקווי תאים ומודלים של בעלי חיים משמשים בדרך כלל למחקר רירית הרחם, אתגרים כגון חוסר יציבות פנוטיפית בקווי תאים, הבדלים בין מינים במודלים של בעלי חיים ומגבלות אחרות מקשים על שכפול המבנה הפיזיולוגי המורכב והשינויים התפקודיים הדינמיים ברירית הרחם האנושית³.

אורגנואידים הם מבנים תלת מימדיים הנוצרים על ידי תרבית תאי גזע בסביבה חוץ-תאית, בעלי יכולות חידוש עצמי וארגון עצמי. הם יכולים לחקות את המבנה והתפקוד של רקמות פיזיולוגיות ופתולוגיות ומוכרים כמודלים פרה-קליניים של מחלות אנושיות⁴. בשנת 2017, בנייה מוצלחת של אורגנואידים של רירית הרחם של עכברים ובני אדם הושגה על ידי הטמעת רקמת רירית הרחם החופשית המקוטעת שהושגה באמצעות עיכול אנזימטי לפיגום מטריצה חוץ-תאית, ואחריה הוספת תערובת של גורמי גדילה ספציפיים וגורמי איתות לגידול⁵. התוצאות הראו כי אורגנואידים של רירית הרחם ex vivo מציגים יכולת שגשוג ארוכת טווח ויציבה, תוך שמירה על מבנה הבלוטות, קוטביות התאים והמאפיינים התפקודיים של אפיתל רירית הרחם, כולל הפרשת ריר ותגובה הורמונלית⁶. עם זאת, תרבית ex vivo של תאי גזע בוגרים היוצרים את האורגנואידים של רירית הרחם דורשת תמיכה מבנית דמוית בלוטה, מה שמוביל לאתגרים כמו אובדן גבעול וקשיים במעבר⁷.

נכון לעכשיו, גידול אורגנואידים של רירית הרחם מסתמך על שיטת תרבית עיכול בלוק הרקמות. במחקר קודם, צוות המחקר שלנו תרבית תאי גזע אפיתל של רירית הרחם האנושית לתקופה ממושכת במבחנה באמצעות מדיום תרבית ראשוני המורכב בעיקר מ-Y27632, בו השתמשנו לבניית אורגנואידים של רירית הרחם⁸. בהתבסס על הצלחה זו, בודדנו ותרבית תאי גזע אפיתל רירית הרחם מרקמת רירית הרחם של חולדות באמצעות מדיום תרבית תרכובת מולקולה קטנה, והקמנו מערכת תרבית חוץ גופית ארוכת טווח. יתר על כן, השתמשנו בתאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs) כדי ליצור אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. פיתוח מודל זה ישפר את מחקרי המבחנה וה-in vivo העתידיים של מחלות הקשורות לרירית הרחם בשילוב עם מודלים של חולדות.

Protocol

בעבודה זו נעשה שימוש בשש חולדות Sprague-Dawley נקבות בנות 7/8 שבועות במשקל 200-250 גרם. החולדות שוכנו במתקן בעלי חיים מבוקר אקלים עם גישה אד-ליביטום למזון ומים. כל הליכי הניסוי הכוללים בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית לניסויים בבעלי חיים בוועדת האתיקה המחקרית של בית החולים העממי מייג'ואו.

הסעיף הבא מתאר את תהליך הבידוד, המעבר, ההקפאה וההפשרה של תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות באמצעות מדיום הרחבה מזוקק של reESCs (REEM) המורכב בעיקר מ-Y27632, A8301 ו-CHIR990217 ^8,9. נוסחת ה-REEM מבוססת על DMEM/F12 נטול סרום המועשר בריכוזים ספציפיים של רכיבי מפתח: 10 מיקרומטר Y27632, 3 מיקרומטר CHIR99021 ו-0.5 מיקרומטר A8301. פרטים מקיפים לגבי הרכיבים ניתן למצוא בטבלת החומרים. לאחר שהחולדות הורדמו בשאיפת איזופלורן, יש ליישם את ההליכים הבאים המתוארים באיור 1.

1. הליך כירורגי

1. להרדים את החולדה על ידי שאיפת איזופלורן.
   1. הניחו את החולדות בתא אינדוקציה מלא באיזופלורן 3-5% מעורבב עם חמצן. אשר הרדמה נכונה על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן ואובדן רפלקס היישור.
   2. לאחר ההרדמה, שמור על החולדות מתחת ל-1-3% איזופלורן באמצעות חרוט אף במהלך ההליך. מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן שהחולדה תחת הרדמה.
2. בצע חתך בקו האמצע של הבטן התחתונה כדי לחשוף את קרני הרחם.
   הערה: יש לעקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני השימוש. אזור הניתוח על החולדה מגולח ומחוטא בתמיסת חיטוי. המנתח לובש כפפות סטריליות, מסכה וחלוק. ההליך הכירורגי מבוצע על וילון סטרילי.
3. בצע חתכים אורכיים משני צידי הרחם כדי לחשוף את רירית הרחם הפנימית. השתמש בלהב אזמל T10 כדי לגרד את רירית הרחם עד שהמשטח מחוספס.
4. לאחר ההליך הכירורגי, העבירו את החולדות לאזור התאוששות סטרילי וחם עם רמות טמפרטורה ולחות מווסתות ועקבו אחריהן מקרוב עד שהן חוזרות להכרה מלאה ויכולות לתמוך בעצמן במצב שכיבה חזה קבוצות של שלוש חולדות לאחר ניתוח בנפרד בכלובים נפרדים. כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח, יש לתת משככי כאבים כמו בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג, תת עורית); יש לחזור על הפעולה כל 8-12 שעות עד 48-72 שעות לפי הצורך.

2. עיבוד רקמות

1. מניחים את כל שברי רירית הרחם בכלי בגודל 3.5 ס"מ ושוטפים אותם פי 3 עם PBS.
2. מערבבים את שברי רירית הרחם עם 3 מ"ל של 1% קולגנאז מסוג I (מדולל ב-0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. סנן את הרקמה הלא מעוכלת באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי לבודד ולאסוף את המסנן להמשך תרבית.
3. זרע את התאים שנאספו לצלחות של 12 בארות במדיום REEM להמשך תרבית. חשב את נפח תרחיף התאים הדרוש כדי לזרוע את התאים בכל באר של צלחת 12 הבארות כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה (בדרך כלל ~1-2 × 10⁵ תאים/באר ב-1.5 מ"ל של REEM).
4. שטפו את התאים שנאספו בשלב 2.2 למשך 3x עם PBS. לאחר הכביסה הראשונית, צנטריפוגה את התאים בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט; השעו מחדש את כדור התא ב-PBS המכיל 1% BSA (אלבומין בסרום בקר) כדי למזער קשירה לא ספציפית ודגירה למשך 15-30 דקות על קרח.
5. דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לסמנים שונים (ראו טבלת החומרים) למשך 30 דקות עד שעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לדלל את הנוגדנים ב-PBS ב-1% BSA לפי הוראות היצרן.
6. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את התאים ב-600 מיקרוליטר של PBS עם 1% BSA לניתוח ציטומטריית זרימה.
7. הגדר את המכשיר עם לייזרים ומסננים המתאימים לפלואורופורים המשמשים בניסוי (למשל, FITC, PE, APC). השתמש בהגדרות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) כדי לשער על אוכלוסיית התאים הבודדים החיה, למעט פסולת וצברי תאים. כייל את ציטומטר הזרימה באמצעות בקרה לא מוכתמת כדי להבטיח יישור נכון. הגדר שערים ספציפיים על סמך הבקרה הלא מוכתמת כדי להגדיר אוכלוסיות חיוביות עבור כל סמן עניין (הסף הוא 0.02%).

3. תרבית ארוכת טווח של תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות

1. בדיקת היווצרות מושבה
   הערה: בדיקה זו סייעה לקבוע את מדיום התרבית האופטימלי עבור reESCs.
   1. זרע P0 מחזיר את ה-ESCs לצלחות של 6 בארות בצפיפות של 1,000 תאים/באר ותרבית אותם במשך 14 יום ב-REEM או ב-REEM חסרי A8301, Y27632 או CHIR99021.
   2. לאחר תקופת התרבות, יש לתקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להכתים אותם בתמיסת סגול קריסטל למשך 20 דקות נוספות.
   3. כמת את מספר אשכולות התאים המכילים יותר מ- 50 תאים. בחר את מדיום התרבות על סמך איזה מדיום תומך בצמיחה של אשכולות תאים.
      הערה: השמטת גורמים ספציפיים מה-REEM הביאה לירידה ביכולת ההתרבות של reESCs (איור 1B,C). בהתבסס על ממצאים אלה, REEM נבחר כמדיום המועדף לתרבית של reESCs כדי לייעל את תנאי הגידול.
2. החלף את ה-REEM כל יומיים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90%, עכלו אותם עם 0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA למשך 5-6 דקות.
3. העברת התאים ביחס של 1:3 ב-REEM.
4. בדיקת התפשטות
   1. זרעו את ה-ReESCs P1, P7 ו-P14 לתוך צלחות של 96 בארות בצפיפות של 4 ×-10³ תאים/באר ב-150 מיקרוליטר של REEM.
   2. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב CCK-8 לכל באר לאחר 24, 48, 72 ו-96 שעות של תרבית, ולאחר מכן דגירה של שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
   3. קבע את קצב ההתפשטות על ידי מדידת הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
5. הכנה ושימוש במאגרים קפואים
   1. הכן את תמיסת הציר הקפוא באמצעות REEM עם 10% DMSO.
   2. קצרו את ה-reESCs עם 0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA.
   3. השעו מחדש את גלולת התא בתמיסת מלאי קפואה בריכוז של 1 × 10⁶ תאים/מ"ל. העבירו את מתלה התאים לצינורות.
   4. הקפיאו את הצינורות תחילה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן העבירו אותם לחנקן נוזלי תוך 24 שעות.
      הערה: אם מתכוונים להפשיר תאים בקרוב, מומלץ לאחסן את התאים הקפואים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך זמן מקסימלי של 6 חודשים.
   5. מחממים את ה-REEM ל-37 מעלות צלזיוס.
   6. אחזרו את ה-reESCs הקפואים וטבלו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות.
   7. העבירו את ה-reESCs המופשרים לצלחות של 6 בארות עם צפיפות זריעה של 1 ×-10⁵ תאים/באר ב-REEM.
6. צביעה אימונופלואורסצנטית
   1. זרעים reESCs בשלב הגידול הלוגריתמי על לוחות u-Slide 8 בארות בצפיפות של 2 × 10³ תאים לבאר, ותרבית אותם ב-REEM.
   2. כאשר ה-reESCs מגיעים למפגש של 90%, תקן אותם עם 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות. שטפו את ה-reESCs עם PBS 2x לפני ואחרי הקיבוע.
   3. לחדור לתאים עם 0.2% טריטון X-100 למשך 10 דקות.
   4. חסמו את התאים עם 30% סרום עיזים מדולל באלבומין 5% סרום בקר (BSA) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-reESCs עם PBS 2x לפני ואחרי החסימה.
   5. דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים (anti-SSEA-1 ואנטי-ציטוקרטין) למשך 12 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-reESCs עם PBS 2x לאחר הדגירה.
   6. דגרו על התאים עם נוגדנים משניים למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-reESCs עם PBS 2x לאחר הדגירה.
   7. צבעו את התאים עם 150 מיקרוליטר של DAPI כדי לסמן את כל הגרעינים.
   8. צלם תמונות של התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

4. הקמת אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות מ-reESCs

1. יצירת האורגנואידים
   1. כאשר reESCs מגיעים למפגש של 70%, עכל את התאים עם 0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA למשך 5-6 דקות.
   2. השעו מחדש 5 × 10⁵ reESCs ב-500 מיקרוליטר של מטריגל מופשר והניחו בצלחות של 12 בארות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר ג'לציה.
   3. לאחר שתערובת התאים-מטריג'ל מתמצקת, הוסיפו 1.5 מ"ל/באר REEM כדי לכסות את המטריגל. החלף את ה-REEM כל 2-3 ימים.
2. צביעה אימונופלואורסצנטית
   1. שאפו את ה-REEM והוסיפו 1 מ"ל/באר של תמיסת קציר אורגנואידים מקוררת מראש בצלחות של 12 בארות. דגירה על קרח למשך 40-60 דקות.
   2. אוספים את האורגנואידים בעזרת פיפטה וצנטריפוגה של פסטר בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. שוטפים את האורגנואידים 2-3x עם PBS.
   4. יש לתקן את האורגנואידים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות ולחסום באמצעות 5% BSA למשך 60 דקות.
      הערה: שטפו פעמיים עם PBS לפני ואחרי כל שלב.
   5. דגרו על האורגנואידים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-1% BSA.
   6. דגרו על האורגנואידים עם נוגדנים משניים למשך שעה בטמפרטורת החדר.
   7. מכתים את האורגנואידים עם 200 מיקרוליטר DAPI.
   8. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
3. הוא מכתים
   1. לייבש את האורגנואידים באמצעות סדרת אתנול מדורגת: 70% אתנול למשך 30 דקות; 80% אתנול למשך 30 דקות; 95% אתנול למשך 30 דקות; 100% אתנול למשך 2 x 30 דקות. נקה את האורגנואידים על ידי טבילתם בקסילן למשך 2 x 30 דקות.
   2. טבלו את האורגנואידים המנוקים בפרפין מומס בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. העבירו את האורגנואידים שחדרו לפרפין לתבניות הטבעה, מלאו את התבניות בפרפין מומס והניחו את התבניות בצלחת קרה כדי שהפרפין יתמצק. הסר את גושי הפרפין מהתבניות לאחר שהפרפין התמצק וחתוך את עודפי הפרפין.
   3. הרכיבו את גושי הפרפין על המיקרוטום. חותכים חלקים בעובי 5 מיקרומטר ומציפים אותם על אמבט מים חמים (42-45 מעלות צלזיוס) לשטח. העבירו בזהירות את החלקים למגלשות זכוכית וייבשו אותם על מחמם שקופיות.
   4. הפזר את החלקים על ידי טבילת שקופיות בקסילן למשך 2 x 5 דקות. התייבש באמצעות סדרה של אתנול מדורג: 100% אתנול למשך 2 x 3 דקות; 95% אתנול למשך 3 דקות; 70% אתנול למשך 3 דקות; שוטפים במים מזוקקים.
   5. מכתים עם המטוקסילין למשך 5 דקות; לאחר מכן, שטפו במי ברז זורמים למשך 5 דקות. להבדיל באלכוהול חומצי 1% למשך מספר שניות; לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 דקות; מניחים בכחול במי אמוניה של 0.2% למשך 30 שניות; לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 דקות; מכתים עם אאוזין למשך 2 דקות. התייבש באמצעות אתנול מדורג: 70% אתנול למשך דקה אחת; 95% אתנול למשך דקה; 100% אתנול למשך 2 x 1 דקה. נקה בקסילן למשך 2 x 1 דקה.
   6. הוסף טיפה של מדיום הרכבה לחלקים המוכתמים. לאחר מכן, הנח כיסוי מעל קטע הרקמה, הימנע מבועות אוויר. התבונן בחלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
4. צביעת פלואורסצנטי
   1. בצע דה-פראפיניזציה והחזרת נוזלים כמתואר בשלבים 4.3.1. עד 4.3.4.
   2. מחממים את תמיסת אחזור האנטיגן במיקרוגל. הנח את השקופיות בתמיסת אחזור האנטיגן המחוממת ושמור אותן בטמפרטורת תת-רתיחה למשך 20 דקות. הניחו לשקופיות להתקרר בתמיסת אחזור האנטיגן למשך 40 דקות. יש לשטוף את המגלשות במים נטולי יונים למשך 5 דקות.
   3. דגרו את המגלשות במי חמצן של 0.3% במתנול למשך 10 דקות כדי להרוות פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. שטפו את השקופיות למשך 3 x 5 דקות ב-PBS ודגרו אותן בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. הקש על תמיסת החסימה העודפת אך אל תשטוף.
   4. יש לדלל את הנוגדן העיקרי בתמיסת חסימה בהתאם להוראות היצרן. מרחו את הנוגדן הראשוני המדולל על חלקי הרקמה ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
   5. שטפו את השקופיות למשך 3 x 5 דקות ב-PBS. יש לדלל את הנוגדן המשני המצומד ל-HRP בתמיסת חסימה בהתאם להוראות היצרן. מרחו את הנוגדן המשני המדולל על חלקי הרקמה ודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. שטפו את השקופיות למשך 3 x 5 דקות ב-PBS כדי להסיר נוגדן משני לא קשור.
   6. הכן את תמיסת העבודה של Fluorescein Tyramide בהתאם להוראות הערכה. מרחו את תמיסת העבודה על חלקי הרקמה ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. שוטפים את השקופיות למשך 3 x 5 דקות ב-PBS.
   7. חזור על שלב 4.4.1. עד 4.4.5 עד להשלמת הצביעה עם כל שלושת הנוגדנים. מרחו טיפה של מדיום הרכבה פלורסנט עם DAPI על כל קטע רקמה. הנח בזהירות כיסוי מעל חלק הרקמה כדי למנוע בועות אוויר. בדוק את השקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
5. PCR כמותי
   1. אסוף את האורגנואידים כמתואר בשלבים 4.2.1. ל-4.2.3. שאפו את ה-PBS וחלצו את סך ה-RNA מהאורגנואידים בהתאם להוראות היצרן.
   2. השתמש בכל ערכת שעתוק הפוך זמינה מסחרית כדי לסנתז cDNA מ-1 מיקרוגרם של RNA כולל. הגדר תגובת q-PCR בהתאם לפרוטוקול יצרן הערכה. ראה טבלת חומרים לרצפי פריימר המשמשים ל-q-PCR.

5. תרבית ארוכת טווח של אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות

1. שאפו את ה-REEM והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת קצירת אורגנואידים למשך 40 דקות כדי לנתק את האורגנואידים. דגירה על קרח כדי לשמור על שלמות האורגנואידים.
2. לאחר הדגירה, אסוף את האורגנואידים באמצעות פיפטה וצנטריפוגה של פסטר בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול אותם להמשך עיבוד.
   הערה: חיתוך קצה הפיפטה יכול להועיל לטיפול באורגנואידים גדולים יותר (מעל 500 מיקרומטר) מבלי לגרום נזק.
3. השעו מחדש את האורגנואידים הגלולים במטריג'ל, ביחס של 1:2 או 1:3, להטמעה ותרבית לאחר מכן בצלחות של 12 בארות.
4. הכן את תמיסת המלאי הקפוא: REEM עם 10% DMSO.
5. קצרו את האורגנואידים, השעו אותם מחדש בתמיסת הציר הקפוא ולאחר מכן אחסנו במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי לשימור לטווח הארוך.
6. כדי להפשיר את האורגנואידים הקפואים, יש לחמם את ה-REEM באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולטבול את צינור הציר הקפוא באמבט המים כדי להפשיר בעדינות את האורגנואידים.
7. לאחר ההפשרה, השעו מחדש את האורגנואידים ב-500 מיקרוליטר של מטריג'ל להטמעה מחדש ותרבית בצלחת של 12 בארות. בצע את שלבים 4.1.2. ל-4.1.3.
   הערה: מומלץ לאחסן אורגנואידים קפואים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפרקי זמן קצרים יותר או להעביר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך יותר.

6. אופציונלי: מעבר אורגנואידים לתרבית דבקה

הערה: הפרוטוקול מזכיר שיטה חלופית להשגת reESCs בתרבית שטוחה על ידי מעבר אורגנואידים לתרבית דביקה, המאפשרת ארגון מחדש של מורפולוגיה אורגנואידית.

1. שאפו את ה-REEM והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת קצירת אורגנואידים כדי לנתק את האורגנואידים. דגירה על קרח כדי לשמור על שלמות האורגנואידים.
2. לאחר הדגירה, אספו את האורגנואידים באמצעות פיפטה פסטר וצנטריפוגה כדי לגלול אותם ב-300 × גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
3. השעו מחדש את האורגנואידים ב-3 מ"ל של REEM שחומם מראש והעבירו את האורגנואידים המרחפים לצלחת בגודל 3.5 ס"מ. החלף את מדיית REEM כל יומיים.
4. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, עכלו אותם עם 0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA למשך 5-6 דקות.
5. שחזר את האורגנואידים עם reESCs על ידי ביצוע שלבים 4.1.1 עד 4.1.3.

7. תרבית רציפה של אורגנואידים עם אסטרדיול (E₂) ופרוגסטרון (P₄)

1. הכן פתרונות מלאי של E₂ ו-P₄ ב-DMSO. לדלל את תמיסות המלאי לריכוזי עבודה רצויים (E₂: 10 ננומטר; P₄: 1 מיקרומטר) ב-REEM, מה שמבטיח שריכוז ה-DMSO הסופי לא יעלה על 0.1% כדי למנוע השפעות ציטוטוקסיות.
2. תרבית אורגנואידים ב-REEM כשלבים 4.1.1. ל-4.1.3. למשך 4 ימים. החלף את המדיום ב-REEM בתוספת E₂ ותרבית למשך 7 ימים. עקוב אחר צמיחת האורגנואידים והמורפולוגיה מדי יום. החלף את המדיום כל 2-3 ימים.
3. החלף את המדיום ב-REEM בתוספת E₂ ו-P₄. עקוב אחר צמיחת האורגנואידים והמורפולוגיה מדי יום. החלף את המדיום כל 2-3 ימים. המשיכו לתרבית את האורגנואידים למשך 7 ימים.

תוצאות

ה-reESCs והאורגנואידים של רחם החולדות הוקמו משש נקבות חולדות Sprague-Dawley במשקל של בין 200 גרם ל-250 גרם בהתאם לפרוטוקול המתואר באיור 1. בהסתמך על ההצלחה של תרבית ארוכת טווח של תאי גזע אפיתל של רירית הרחם האנושית, נוסחת ה-REEM כללה בעיקר Y27632, A8301 ו-CHIR99021. כדי לייצב את ה-reESC...

Discussion

במחקר זה, תיארנו שיטה פשוטה לבידוד ותרבות תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs) ושכללנו את מערכת ex vivo שהוקמה בעבר עבור תאי גזע אפיתל רירית הרחם האנושיים⁸. הגישה שלנו משתמשת במדיום תרבית מולקולות קטן המכיל Y27632, A8301 ו-CHIR99021 כרכיבי ליבה כדי לאפשר תרבית ex ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG